最新微生物限度检查方法验证方案

1、微生物限度检查方法验证方案六、验证内容1.供试液的制备1.1.取供试品10g，加pH7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液至100ml，充分振摇使混匀，作为1:10的供试液。1.2.取1:10供试品10ml，加pH7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液至100ml，充分振摇使混匀，作为1:100的供试液。1.3.取1:100供试品10ml，加pH7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液至100ml，充分振摇使混匀，作为1:1000的供试液。备注：供试液制备若需加温时，应均匀加热，且温度不超过45。供试液从制备至加入检验用培养基，不得超过1小时。2.菌液制备2.1.接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌的新

2、鲜培养物至胰酪大豆胨液体培养基中，3035培养1824小时；分别取上述培养物用0.9%无菌氯化钠溶液或pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，依次稀释至、制成每1ml含菌数为小于100cfu的菌悬液。2.2.接种白色念珠菌的新鲜培养物至沙氏葡萄糖液体培养基中，2025培养23天；取此培养物用0.9%无菌氯化钠溶液或pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，依次稀释至，制成每1ml含菌数为小于100cfu的菌悬液。2.3.将黑曲霉菌斜面的新鲜培养物接种至沙氏葡萄糖琼脂斜面培养基上，2025培养57天，使大量的孢子成熟。加入3-5ml含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液或pH7.0

3、无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，将孢子洗脱。然后，采用适宜方法吸出孢子悬液至无菌试管内，用含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液或pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液依次稀释至，制成每1ml含孢子数小于100cfu的孢子悬液。2.4.上述菌悬液制备后若在室温下放置，应在2小时之内使用；若保存在28，可在24小时内使用。黑曲霉孢子悬液可保存在28，在验证过的贮存有效期内使用。3.计数方法的验证3.1.需氧菌、霉菌及酵母菌计数（平皿法）所加菌液的体积不得超过供试液体积的1%。为确认供试品中的微生物能被充分检出，首先应选择最低稀释级的供试液进行计数方法适用性检查。3.1.1.试验组取

4、上述制备好的供试液，加入试验菌液、混匀，使每1ml供试液或每张滤膜过滤的供试液中含菌量不大于100cfu。取的供试液9.9ml和小于10000cfu的铜绿假单胞菌菌悬液0.1ml混匀后，吸取1ml注入平皿中，立即倾注胰酪大豆胨琼脂培养基1520ml，混匀，凝固，于3035倒置培养3天点计菌落数。平行制备2个平皿。取的供试液9.9ml和小于10000cfu的金黄色葡萄球菌菌悬液0.1ml混匀后，吸取1ml注入平皿中，立即倾注胰酪大豆胨琼脂培养基1520ml，混匀，凝固，于3035倒置培养3天点计菌落数。平行制备2个平皿。取的供试液9.9ml和小于10000cfu的枯草芽孢杆菌菌悬液0.1ml混匀

5、后，吸取1ml注入平皿中，立即倾注胰酪大豆胨琼脂培养基1520ml，混匀，凝固，于3035倒置培养3天点计菌落数。平行制备2个平皿。取的供试液9.9ml和小于10000cfu的白色念珠菌菌悬液0.1ml混匀后，吸取1ml注入平皿中，立即倾注胰酪大豆胨琼脂培养基1520ml，混匀，凝固，于3035倒置培养3天点计菌落数。平行制备2个平皿。取的供试液9.9ml和小于10000cfu的黑曲霉菌悬液0.1ml混匀后，吸取1ml注入平皿中，立即倾注胰酪大豆胨琼脂培养基1520ml，混匀，凝固，于3035倒置培养3天点计菌落数。平行制备2个平皿。取的供试液9.9ml和小于10000cfu的白色念珠菌菌悬液

6、0.1ml混匀后，吸取1ml注入平皿中，立即倾注沙氏葡萄糖琼脂培养基1520ml，混匀，凝固，于2025倒置培养5天点计菌落数。平行制备2个平皿。取的供试液9.9ml和小于10000cfu的黑曲霉菌悬液0.1ml混匀后，吸取1ml注入平皿中，立即倾注沙氏葡萄糖琼脂培养基1520ml，混匀，凝固，于2025倒置培养5天点计菌落数。平行制备2个平皿。3.1.2.菌液组取小于100cfu的铜绿假单胞菌菌悬液、金黄色葡萄球菌菌悬液、枯草芽孢杆菌菌悬液、白色念珠菌菌悬液、黑曲霉菌悬液各1ml，注入平皿中，立即倾注胰酪大豆胨琼脂培养基约1520ml，混匀，凝固，于3035倒置培养3天点计菌落数。各平行制备

7、2个平皿。取小于100cfu的白色念珠菌菌悬液、黑曲霉菌悬液各1ml，立即倾注沙氏葡萄糖琼脂培养基各1520ml，混匀，凝固，于2025倒置培养5天点计菌落数。各平行制备2个平皿。3.1.3.供试品对照组取的供试液1ml，注入平皿中，分别立即倾注1520ml温度不超过45胰酪大豆胨琼脂培养基和沙氏葡萄糖琼脂培养基，混匀，凝固，胰酪大豆胨琼脂培养基3035倒置培养3天点计菌落数，沙氏葡萄糖琼脂培养基2025倒置培养5天点计菌落数。各组平行制备2个平皿。3.1.4.结果判断3.1.4.1计算公式： 稀释剂对照组菌数的回收率=（稀释剂对照组的平均菌落数供试品对照组的平均菌落数）/菌液组的平均菌落数

8、试验组菌数的回收率=（试验组的平均菌落数供试品对照组的平均菌落数）/菌液组的平均菌落数3.1.4.2判定标准：实验组、稀释剂对照组（如有）的菌数回收率应在0.52之间。若各试验菌的回收率均符合规定，照所用的供试液制备方法及计数方法进行该供试品的需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数计数。3.1.5试验结果供试品批号、。菌种类型试验次数菌液组实验组供试品对照组回收率铜绿假单胞菌1平均2平均3平均金黄色葡萄球菌1平均2平均3平均枯草芽孢杆菌1平均2平均3平均白色念珠菌（需氧菌验证）1平均2平均3平均黑曲霉（需氧菌验证）1平均2平均3平均白色念珠菌（霉菌、酵母菌验证）1平均2平均3平均黑曲霉（霉菌、酵母菌验证

9、）1平均2平均3平均结果判定：验证人： 复核人：日期： 日期：4.控制菌检查4.1.（大肠埃希菌）的验证4.1.1.试验组取的供试液ml（取相当于1g或1ml供试品的供试液），小于100cfu的大肠埃希菌菌悬液1ml，加至约100ml的胰酪大豆胨液体培养基，于3035培养1824小时。4.1.2.阴性对照组取pH7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液10ml，加至约100ml的胰酪大豆胨液体培养基，于3035培养1824小时。4.1.3.阳性对照组取小于100cfu的大肠埃希菌菌悬液1ml，加至约100ml的胰酪大豆胨液体培养基，于3035培养1824小时。4.1.4.检查取上述培养物1ml，接种至含1

10、00ml麦康凯液体培养基内培养，4244培养2448小时。取麦康凯液体培养物划线接种于麦康凯琼脂平板上3035培养1872小时。检查结果如下：第一次试验结果：供试品批号：序号步骤实验组阳性对照组 阴性对照组1胰酪大豆胨液体培养基，3035培养1824小时 2麦康凯液体培养基，4244培养2448小时3取麦康凯液体培养物划线接种于麦康凯琼脂平板上，3035培养1872小时若麦康凯琼脂培养基平板上有菌落生长，应进行分离、纯化及适宜的鉴定试验, 确证是否为大肠埃希菌；若麦康凯琼脂培养基平板上没有菌落生长，或虽有菌落生长但鉴定结果为阴性，判未检出大肠埃希菌。4分离纯化、染色镜检、生化试验等结果：第二次

11、试验结果：供试品批号：序号步骤实验组阳性对照组 阴性对照组1胰酪大豆胨液体培养基，3035培养1824小时 2麦康凯液体培养基，4244培养2448小时3取麦康凯液体培养物划线接种于麦康凯琼脂平板上，3035培养1872小时若麦康凯琼脂培养基平板上有菌落生长，应进行分离、纯化及适宜的鉴定试验, 确证是否为大肠埃希菌；若麦康凯琼脂培养基平板上没有菌落生长，或虽有菌落生长但鉴定结果为阴性，判未检出大肠埃希菌。4分离纯化、染色镜检、生化试验等结果：第三次试验结果：供试品批号：序号步骤实验组阳性对照组 阴性对照组1胰酪大豆胨液体培养基，3035培养1824小时 2麦康凯液体培养基，4244培养2448小时3取麦康凯液体培养物划线接种于麦康凯琼脂平板上，3035培养1872小时若麦康凯琼脂培养基平板上有菌落生长，应进行分离、纯化及适宜的鉴定试验, 确证是否为大肠埃希菌；若麦康凯琼脂培养基平板上没有菌落生长，或虽有菌落生长但鉴定结果为阴性，判未检出大肠埃希菌。4分离纯化、染色镜检、生化试验等结果：标准：阳性对照和试验组应检出大肠埃希菌，阴性对照应无菌生长。 结果判定：验证人： 复核人：日期： 日期：备注：采用以上供试液制备方法，分别对需氧菌、霉菌及酵母菌计数和控制菌检查法进行方法验证时，若结果不