微波调节肢体慢性淋巴水肿纤维化机理的研究

1、    微波调节肢体慢性淋巴水肿纤维化机理的研究        【摘要】目的探讨微波烘疗对肢体慢性淋巴水肿纤维化的影响。方法应用ABC免疫组化及原位杂交技术观察患肢皮肤组织TGF-和、型前胶原mRNA及多肽含量变化。结果烘疗前TGF-1多肽位于表皮棘层、颗粒层细胞，真皮及皮下组织中见大量、型胶原纤维并有TGF-和、型前胶原mRNA表达增加；烘疗后表皮细胞TGF-1阳性染色变浅，、型前胶原纤维变细，TGF-和、型前胶原mRNA表达降低。结论肢体慢性淋巴水肿纤维化发生，与相关基因

2、TGF-的过量表达导致、型胶原等细胞外基质合成增加和沉积有关，微波烘疗可以抑制TGF-基因表达及多肽的合成，通过减少、型前胶原mRNA表达及胶原合成逐步逆转皮肤组织纤维化。【关键词】淋巴水肿纤维化微波免疫组化原位杂交 Microwave heating modulation of skin fibrosis in chronic extremity lymphedemaCAO Weigang, ZHANG Disheng, GAN Jiliang(Department of Plastic and Reconstructive Surgery, The Ninth People's H

3、ospital, Shanghai 200011,China)【Abstract】ObjectiveTo observe the effects of microwave heating on skin fibrosis in chronic extremity lymphedema.MethodsSkin specimens from 8 cases of chronic limb lymphedema were tested by in situ hybridization (ISH) combined with avidin-biotin peroxidase (ABC) immunoh

4、istochemistry for detection of TGF-， procollagen ， procollagen mRNAs and corresponding peptides expressions.ResultsIt was discovered that expressions of TGF-1 peptide were located at the spinous and granular layer of the epidermal cells with a great amount of dermal collagen ， formation in accordanc

5、e with high expressions of TGF-， procollagen ， procollagen mRNAs in the dermal and subcutaneous tissue fibroblasts. After microwave heating treatment, the epidermal expression of TGF-1 and relative TGF-，procollagen , procollagen mRNAs expressions in dermal fibroblasts were greatly reduced. The small

6、er calibre of collagen fibers after microwave heating was also observed. ConclusionsIt is indicated that fibrosis in lymphedema is resulted from over-expressions of relevant genes like TGF- and subsequent extracellular matrixes (ECM) syntheses and deposition. Microwave heating can reduce fibroblast

7、expressions of TGF-， procollagen , procollagen mRNAs as well as TGF- peptide synthesis, inhibiting ECM syntheses and deposition and finally reverse the skin fibrosis process.【Key words】Lymphedema;Fibrosis；Microwave；Immunohistochemistry;In situ hybridization肢体淋巴水肿的主要病理特征之一是病变肢体浅层组织的纤维化，其严重程度可代表病情的严重性

8、，同时亦可作为考核某一方法疗效的直接依据。胶原基本结构单位肽链通过相应的mRNA模板合成，相应基因表达的多少即mRNA含量的多少直接决定了细胞合成胶原的多少，因此，直接测定前胶原肽链mRNA含量，较羟脯氨酸测量法1更能进一步从分子水平反映胶原代谢的实际情况。成纤维细胞中胶原基因表达及胶原分子合成受多种因素制约，而TGF-是胶原基因表达的强力促进者2，3，在慢性肢体淋巴水肿纤维化进程中，是否有TGF-mRNA和TGF-多肽合成的改变，目前尚不清楚。我们采用原位杂交及免疫组织化学法分别观察了TGF-、和型前胶原mRNA和多肽含量变化，以确定其在慢性肢体淋巴水肿皮肤组织纤维化形成中的作用，同时观察微

9、波烘疗的影响，试从分子水平上阐明微波烘疗减轻纤维化的作用机理。1材料和方法1.1病例选择本组共8例，其中男性4例，女性4例，年龄868岁，平均33.6岁。烘疗前后皮肤组织活检取自内踝内上方相近部位，另外还以2例正常皮肤作为对照。1.2临床纤维化观察指标应用组织张力计测定皮肤组织弹性，将微波烘疗前后的测定值相比较，行配对t检验。1.3改良胶原VG染色扩散度高的小分子染料苦味酸介入结构致密的组织间隙，将组织染成黄色，而扩散度低的大分子染料丽春红，将结构疏松的胶原组织染成红色。1.4免疫组化采用卵白素-生物素复合物(ABC)免疫组化法观察微波烘疗前后病变皮肤组织TGF-1及、型胶原含量变化，阳性表达

10、呈棕色。相应一抗均由武汉博士德(BOSTER)生物工程有限公司提供。1.5原位杂交法2结果2.1胶原VG染色烘疗前真皮层及皮下组织中染成红色的胶原纤维粗大，伴有较明显的束间水肿(1)，治疗后可见纤维条束变细、稀疏，束间水肿明显减轻，提示有降解吸收(2)。1烘疗前胶原纤维束粗大致密伴有束间水肿，改良VG染色×100Fig.1Thick collagen bundles with edema before microwave treatment (Modified VG Stain×100)2烘疗后胶原束变细、稀疏，束间水种减轻，改良VG染色×100Fig.2Coll

11、agen bundles become finer with edema regression after the treatment (Modified VG Stain)2.2TGF-1及、型胶原含量变化患肢皮肤皮下组织、型胶原染色表现为弥散性索条状改变，烘疗前较为致密(3)，TGF-1染色阳性细胞主要位于表皮，以棘层、颗粒层细胞为明显，而基底层细胞则为阴性(5)；真皮组织中血管周围偶见阳性细胞。烘疗后阳性染色胶原纤维变稀疏(4)。TGF-1染色阳性之表皮细胞数量减少、染色变浅(6)。3烘疗前型胶原纤维致密，排列紊乱，ABC法×100Fig.3Irregular collagen

12、 fibers before the treatment(ABC×100)4烘疗后型胶原纤维变稀疏、排列整齐，ABC法×100Fig.4Thinner and regular arranged collagen fibers after the treatment(ABC×100)5烘疗前患肢表皮TGF-1染色阳性，ABC法×200Fig.5TGF-1 positive staining in affected epidermal layersbefore the treatment(ABC×200)6烘疗后表皮TGF-1染色阳性表达降低，AB

13、C法×200Fig.6Lessened TGF-1 expression in epidermal layers after the treatment(ABC×200)2.3TGF- mRNA及、型前胶原mRNA含量变化8例中6例可见较明显的TGF- mRNA及、型前胶原mRNA表达，主要位于真皮层成纤维细胞胞浆及其周围(7)，血管周围炎性细胞及周围表达不明显。正常皮肤及皮下组织成纤维细胞则较少见到类似表达。治疗后，成纤维细胞TGF- mRNA及、型前胶原mRNA表达明显降低(8)。7烘疗前真皮成纤维细胞TGF-mRNA表达明显，ISH×400Fig.7Obvi

14、ous TGF- mRNA expressions in dermal fibroblasts before the treatment(ISH×400)8烘疗后真皮成纤维细胞TGF-mRNA表达明显降低，ISH×400Fig.8Decreased TGF- mRNA expressions in dermal fibroblasts after the treatment(ISH×400)3讨论TGF-的生物学活性十分复杂，具有显著的促炎症反应，促进纤维连接蛋白(Fibronectin, FN)、Tenascin、胶原和蛋白聚糖等细胞外基质(extracellu

15、lar matrix, ECM)的合成和沉积作用4，5，同时通过降低蛋白酶的合成和增加蛋白酶抑制剂的生成抑制基质降解6。以上特性，结合其自诱导生成作用7，在炎症的早期及创伤愈合的早期将起到积极作用。但是，TGF-的自诱导正反馈调节作用，如不能被及时抑制，将诱导损伤部位过量的ECM沉积，是形成慢性、进行性瘢痕、纤维化直至破坏正常组织结构的主要原因。以往人们在肾小球、肺、肝脏等部位的纤维化研究中也发现，TGF-异常增高是纤维增生的一个决定性因素8-11。我们的研究结果证实，发生慢性肢体淋巴水肿时，局部组织成纤维细胞有TGF- mRNA及、型前胶原mRNA的表达增加，经微波烘疗后，TGF- mRNA

16、及多肽的表达均有所降低。产生这种变化的可能原因是慢性肢体淋巴水肿时皮肤及皮下组织慢性炎症反应，局部单核细胞、T淋巴细胞、成纤维细胞等释放包括TGF-在内的各种细胞因子，且TGF-通过其自诱导及旁分泌途径，调控TGF- mRNA表达增加7，从而源源不断的产生出更多的TGF-，过量的TGF-又诱发了、型前胶原等ECM mRNA表达的增加，这与我们烘疗前观察到的结果相吻合，、型前胶原mRNA表达增加促进ECM合成及沉积，最终导致纤维化形成。已知微波烘疗能显著减轻皮肤、皮下组织小血管周围的炎性细胞浸润12，这将打断TGF-不断形成的基础，相应的TGF- mRNA及、型前胶原mRNA表达降低，胶原等EC

17、M合成减少，且TGF-尚有抑制胶原酶基因表达、阻止胶原降解的作用，TGF-的降低也将有助于胶原降解6，通过降低胶原等ECM可合成及增加其降解最终纤维化得到改善。临床表现为组织弹性升高，、型胶原变纤细，VG染色示胶原束变稀疏等。微波烘疗减轻纤维化的另一机理可能是通过直接调控TGF- mRNA及、型前胶原mRNA表达的降低，从而抑制TGF-及ECM合成来实现。此外，在我们的研究中发现，TGF-1 mRNA表达主要位于真皮层成纤维细胞中，而TGF-1多肽表达则主要位于表皮层，一种可能的情况是表皮角质细胞本身合成了TGF-，另一种情况则是真皮层其他细胞如成纤维细胞合成后转运到此，尚有待进一步研究。作者

18、单位：曹卫刚(200011上海第二医科大学附属第九人民医院整复外科)张涤生(200011上海第二医科大学附属第九人民医院整复外科)干季良(200011上海第二医科大学附属第九人民医院整复外科)参考文献2，Wahl SM. Transforming growth factor beta (TGF-) in inflammation: a cause and a cure. J Clin Immunol, 1992,12:61-74.3，Varga J, Rosenbloom J, Jimenez SA. Transforming growth factor (TGF-) causes a per

19、sistent increase in steady-state amount of type and type collagen and fibronectin mRNAs in normal human dermal fibroblasts. Biochem J, 1987,247:597-604.4，Roberts AB, Sporn MB, Assoian RK, et al. Transforming growth factor-: rapid induction of fibrosis and angiogenesis in vivo and stimulation of coll

20、agen formation in vitro. Proc Natl Acad Sci USA, 1986,83:4167-71.5，Iganotz RA, Massague J. Transforming growth factor- stimulates the expression of fibronectin and collagen and their incorporation into the extracellular matrix. J Biol Chem, 1986,261:4337-4345.6，Edwards DR, Murphy G, Reynolds JJ, et

21、al. Transforming growth factor beta modulates the expression of collagenase and metalloproteinase inhibitor. EMBO J, 1987,6:1899-1904.7，Kim SJ, Jeang KT, Glick AB, et al. Promoter sequences of the human transforming growth factor-1 gene responsive to transforming growth factor-1 autoinduction. J Biol Chem, 1989,264:7041-7045.8，Okuda S, Languino LR, Ruoslahti E, et al. Elevated expression of transforming growth factor- and proteoglycan production in experimental glomerulonephritis. Possible role in expansion of the mesangial extracellular matrix. J Clin Invest, 1990,86;453-462.9