酿酒酵母ARS304及其侧翼序列重组质粒的构建与鉴定-

1、第21期收稿日期:2011-12-16基金项目:国家自然科学基金(61072129;内蒙古科技大学创新基金(2011NCL005作者简介:李珺(1979-,女,宁夏石嘴山人,讲师,硕士,主要从事表观遗传学研究,(电话158*(电子信箱star1979 ;通讯作者,蔡禄,男,教授,博士生导师,主要从事生物信息学与分子生物学研究工作。复制起始的调控涉及细胞周期的调控、基因扩增、肿瘤发生等重大生物学问题,是真核生物基因表达调控的重要内容。酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae 中复制起始依赖的顺式作用元件被称为自主复制序列(Autonomously replicating sequ

2、ence ,ARS ,典型的ARS 有一段11bp 富含A /T 的保守序列5-(A /T TTTA (T /C (A /G TTT (A /T -3,称为ACS (ARS consensus sequence ,这些位点发生突变时会导致ARS 失去活性,进而影响到复制起始的功能。在酿酒酵母号染色体上已发现有19个ARS 元件,但却存在超过3800个与ACS 相似的序列,并且其中60%的序列能与ACS 的810个位点匹配1,说明自主复制并不单纯受ACS 元件数目、方向以及解旋基序数目所控制,其活性可能还与其他因素有关,诸如ARS 侧翼序列特征、核小体定位、染色质修饰等2。对酵母的ARS 进行研

3、究,了解酵母染色体复制起始机制,有利于进一步在表观遗传学水平上探究真核生物复制机理。本实验构建并鉴定酿酒酵母ARS304及其侧翼序列重组质粒,以期为以酵母为模式生物研究真核基因复制机制提供参考。1材料和方法1.1材料1.1.1菌株和质粒Esherichia coli DH5为内蒙古科技大学基因工程实验室保藏。酿酒酵母YPH499(MATa ura3-52lys2-801amber ade2-101ochre trp1-63his3-200leu2-1、穿梭质粒酿酒酵母ARS304及其侧翼序列重组质粒的构建与鉴定李珺,王馨,张启声,蔡禄(内蒙古科技大学生物工程与技术研究所,内蒙古包头014010

4、摘要:采用PCR 扩增酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae 号染色体ARS304序列(S 1及以ARS304为核心上下游延伸1kb 的侧翼序列(S 2,并将目的片段分别构建到酵母整合载体pRS405中,获得重组质粒pRS 1和pRS 2。质粒电转化试验发现重组质粒pRS 2的转化率大于pRS 1,说明ARS304侧翼序列能显著提高ARS304在酿酒酵母中自主复制的能力。关键词:酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae ;自主复制序列(ARS ;重组质粒;复制起始活性中图分类号:Q785文献标识码:A文章编号:0439-8114(201221-4891-0

5、3Construction and Identification of Recombinant Plasmids ofSaccharomyces cerevisiaeARS304and Its Flank SequenceLI Jun ,WANG Xin ,ZHANG Qi-sheng ,CAI Lu(Institute of Bioengineering and Technology ,Inner Monglia University of Science and Technology ,Baotou 014010,Inner M o nglia ,China Abstract :ARS30

6、4gene (S 1and its flank sequence (S 2of Saccharomyces cerevisiae w ere cloned by PCR ,and then connect-ed into the shuttle vector pRS405.Recombinant plasmids pRS 1and pRS 2w ere successfully constructed and used for electropo-ration of S.cerevisiae .Results showed that the electricity transformation

7、 rate of pRS 2was higher than that of pRS 1,indicating that flank sequence could improve the autonomously replicating activity of ARS304in S.cerevisiae.Key words :Saccharomyces cerevisiae ;autonomously replicating sequence (ARS ;recombinant plasmids ;replication origins activity第51卷第21期2012年11月湖北农业科

8、学H ubei A gricultural S ciencesVol.51No.21Nov .,2012湖北农业科学2012年pRS405由美国新泽西州医学院微生物学与分子遗传学部Carol S.Newlon教授提供。1.1.2酶与试剂DNA Marker、限制性内切酶、T4 DNA连接酶、Taq DNA聚合酶、PCR产物纯化试剂盒购自Ta K a R a公司,Agarose购自Invitrogen公司。PCR引物合成及DNA测序工作由生工生物工程(上海股份有限公司完成。1.1.3培养基和培养条件大肠杆菌的培养使用LB培养基(胰蛋白胨10g/L+NaCl10g/L+酵母浸提物5g/L,固体培养

9、基添加15g/L琼脂,培养条件为37振荡培养24h;酵母YPH499的培养使用YPD培养基(胰蛋白胨20g/L+酵母浸提物10g/L,高压灭菌20min后加入100mL灭菌的20g/L葡萄糖溶液,固体培养基添加15g/L琼脂,培养条件为28暗培养18h。1.2方法1.2.1珠磨法提取酿酒酵母基因组DNA收集培养1618h的酵母YPH499菌液,用TE洗涤2次后溶于200L TE;加入50mg玻璃珠(直径0.30.5 mm和100L苯酚氯仿(体积比2524,下同,涡漩振荡23min,12000r/min离心2min;取上清,加入等体积苯酚氯仿,振荡混匀后12000r/min 离心5min;取上清

10、,加入0.5L Rnase A,37温浴30min;加入2倍体积的无水乙醇,-20静置30 min;10000r/min离心5min,沉淀物用70%(体积分数,下同的乙醇洗2次,自然干燥后溶于20L TE,采用0.8%的琼脂糖凝胶电泳检测提取的DNA3。1.2.2ARS304及侧翼序列片段PCR扩增及纯化根据Saccharomyces Genome Database中酿酒酵母号染色体上的ARS304序列设计两对引物分别扩增酿酒酵母ARS304(S1及以ARS304为核心上下游延伸1kb的序列(S2。引物序列分别为PF1: 5-CGGGATCCCGGAAGTGCAGAACAAAGAGG-3(Ba

11、m H,PR1:5-CGCGAGCTCGGCAGGAGCAG CACACAGATC-3(Sac;PF2:5-CGGGATCCCGC TAGTGCTTAAGTTCTGTTG-3(Bam H,PR2: 5-CGCGAGCTCGGCAGTCTTTAAACGCGCCTT-3(Sac。以酿酒酵母YPH499基因组为模板,利用上述引物扩增酿酒酵母ARS304及侧翼序列。扩增体系为50L:ddH2O37L、10×Buffer(Mg2+5L、dNTPs4L、P F(10mol/L0.5L、P R(10mol/L 0.5L、Taq DNA聚合酶1L、DNA模板2L。扩增程序为954.0min;9530

12、s,5135s(S2: 4845s,721min;7210min,30个循环。0.8%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物,并采用纯化试剂盒进行回收纯化。1.2.3重组质粒pRS1、pRS2的构建对纯化后的PCR产物和酵母穿梭载体pRS405进行Bam H/ Sac双酶切;连接pRS405酶切大片段和S1(S2双酶切产物;连接产物转化大肠杆菌DH5;提取质粒,对其分别进行Pst/Sac和Sac/Hind双酶切验证,验证正确的重组质粒命名为pRS1及pRS2。1.2.4酵母电转化具体方法参考文献4,转化效率=产生的转化子数/质粒DNA质量。2结果与分析2.1酿酒酵母基因组DNA的提取结果酿酒酵母细胞壁

13、厚约25nm,以葡聚糖为主,有一定韧性。因此提取酵母基因组DNA的关键在于选择一种合适的方法破壁,使菌体内的核酸释放出来。目前报道的酵母基因组DNA的提取方法主要有碱裂解法、液氮研磨法、超声波法、复合酶法、珠磨法等。本实验采用珠磨法提取酵母基因组,琼脂糖凝胶电泳检测结果见图1,可以看出,提取的酵母基因组DNA条带清晰明亮,没有拖带。珠磨法价格便宜,操作简单,提取的酿酒酵母基因组满足后续扩增目的片段的需要。2.2S1、S2序列的PCR扩增以酿酒酵母YPH499基因组为模板扩增ARS304(S1,486bp和以ARS304为核心上下游延伸1kb的侧翼序列(S2,2358bp,采用0.8%的琼脂糖凝

14、胶电泳检测PCR扩增产物,结果见图2、图3。从图中可以看出,目的片段条带单一清晰、大小与预期相符。2.3重组质粒pRS1及pRS2克隆的鉴定将PCR扩增产物S1及S2经Bam H/Sac双酶切后分别连接到穿梭载体pRS405上,连接产物转化大肠杆菌DH5,随机挑取转化子,提取质粒后分别用Pst/Sac和Sac/Hin d双酶切检测(图4、图5。结果显示,重组质粒pRS1经过Pst/ Sac双酶切后出现大小两条带,短片段的大小约M.DNA Marker;1.酵母YPH499基因组DNA图1酵母YPH499基因组 DNAM110kb1kb4892第21期(下转第4898页为550bp ;重组质粒p

15、RS 2经过Sac /Hin d 双酶切后出现两条带,大小约为5500bp 和2400bp ,均与预期相符。2.4重组质粒pRS 1及pRS 2功能鉴定酵母转化效率是鉴定自主复制活性强弱的直接指标。本实验以整合型质粒pRS405为阳性对照,将构建的重组质粒pRS 1及pRS 2电转化酿酒酵母YPH499,在SD 平板上筛选Leu+的转化子,根据酵母转化效率判断3种质粒的自主复制活性,结果见图6。图6显示整合型质粒pRS405由于其复制依赖于整合到酵母的染色体上,转化率低(6转化子/gDNA ,而同等条件下在pRS405多克隆位点插入ARS304,整合型质粒转变成复制型质粒pRS 1,转化率是原

16、来的8.8倍(53转化子/g DNA ;重组质粒pRS 2由于包含以ARS304为核心上下游延伸1kb的侧翼序列,转化率有了显著提高(324转化子/gDNA ,说明ARS304侧翼序列能显著提高ARS304的自主复制活性。3小结与讨论在真核细胞中,DNA 复制是在特定复制起始点上开始的。酵母中潜在的起始点比在每个细胞周期中实际使用的起始点要多。虽然在酵母中大多数ARS 都被复制起始识别复合体(Origin recognitioncomplex ,ORC 结合5,但其中有些位点的使用频率比其他位点的更高,且有一些潜在的起始点在正常生长条件下从不使用。但是当克隆到质粒上时,这些序列也能作为有效的起

17、始点行使功能6。因此,在酵母细胞核中染色体的环境能决定哪些潜在的位点被用作起始点以及使用的频率。如酵母号染色体上有19个ARS ,但由于侧翼序列的影响,并不是所有的都具有复制起始活性或活性较低7。Srienc等8研究发现敲除号染色体上其他高活性ARS 时,ARS304的复制起始活性会大大增强。Eaton 等2利用高通量的序列分析测定了酵母体内ARS 两侧的核小体定位图谱,发现酵母复制起始位点ARS 两侧的核小体分布具有一定的规律,且ORC 的结合也需要ARS 两侧精确的核小体定位。本研究成功构建了酵母号染色体HML 区外第一个活性较低的ARS304及以ARS304为核心上下游延伸1kb 的侧翼

18、序列的重组质粒pRS 1和350300250200150100500转化率/转化子/g D N ApRS405pRS 1pRS 2M.DNA Marker ;1.ARS304及侧翼序列图3ARS304侧翼序列PCR 扩增产物M.DNA Marker ;1.pRS405;2.pRS 2;3.pRS 2的Sac /Hin d 双酶切产物图5重组质粒pRS 2的酶切鉴定结果图6pRS405、pRS 1、pRS 2 的转化效率M 1500bp 100bpM.DNA Marker ;1.ARS304图2ARS304PCR 扩增产物M15kb1kbM1500bp 100bpM.DNA Marker ;1.

19、pRS 1;2.pRS 1的Pst /Sac 双酶切产物图4重组质粒pRS 1的酶切鉴定结果M1235kb1kb李珺等:酿酒酵母ARS304及其侧翼序列重组质粒的构建与鉴定4893湖北农业科学2012年 定性高。可见采用改良的CTAB 法提取百合鳞片总DNA 所得DNA 纯度高、质量好,适于进行SRAP-PCR 等分子生物学实验。3小结与讨论植物总DNA 的提取是一项常规的分子生物学实验技术。植物材料中的多糖在DNA 提取过程中会形成难溶的胶状物与DNA 共沉淀。从多糖、多酚含量较高的植物中提取高质量的DNA 仍具有一定难度。目前已有多种方法去除DNA 提取过程中的多糖5,多数方法针对的是糖类

20、含量少的新鲜材料,需经过繁琐的纯化步骤。百合鳞片中含有较多的糖类、酚类等次生代谢产物,严重影响了DNA 的提取质量。采用常规的CTAB 法提取百合总DNA ,65水浴时会氧化变褐,在加入乙醇沉淀DNA 时多糖也被沉淀,在SRAP-PCR 扩增中谱带极弱或无谱带出现,不能满足SRAP-PCR 实验要求。本研究将CTAB 提取缓冲液中NaCl 浓度提高到2.5mol /L 、加入0.01mol /L -巯基乙醇,水浴过程中管内材料无褐色出现,说明组织的氧化程度降低;用75%的乙醇沉淀DNA 时多糖含量也降低,DNA 的质量明显提高。将提取的百合鳞片DNA 用于SRAP-PCR 扩增,出现明显的谱带

21、,重复性和稳定性较好,完全满足扩增的需要,可用于基于SRAP 分子标记的百合遗传多样性研究。参考文献:1国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部S .北京:化学工业出版社,2005.80.2王连英.花卉学M .北京:中国林业出版社,1988.362-364.3张克中,贾月慧,张启翔,等.部分中国野生百合亲缘关系的AFLP 技术分析J .东北林业大学学报,2008,36(2:19-22.4左志锐,穆鼎,高俊平,等.百合遗传多样性及亲缘关系的RAPD 分析J .园艺学报,2005,32(3:468-472.5崔光红,唐晓晶,黄璐琦.含淀粉及多糖类中药材DNA 的提取方法研究J .中国中药杂志,20

22、06,31(16:1365-1367.!1-10.百合鳞片总DNA ;M.DNA Marker图1百合鳞片总DNA琼脂糖凝胶电泳检测图谱M.DNA Marker ;1-7.样本1的SRAP-PCR 扩增产物;8-15.样本2的SRAP-PCR 扩增产物;16-23.样本3的SRAP-PCR 扩增产物图2SRAP-PCR 扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图谱123M 4567891011121314151617181920212223(上接第4893页pRS 2。质粒电转化试验发现ARS304侧翼序列能显著提高ARS304的复制活性。后续研究将在pRS 1、pRS 2重组质粒上组装核小体,研究核小体的分

23、布及定位对复制起始活性的影响。参考文献:1THEIS J F ,NEWLON C S.Two compound replication originsin Saccharomyces cerevisiae contain redundant origin recogni-tion complex binding sites J .Molecular and Cellular Biology ,2001,21(8:2790-2801.2EATON M L ,GALANI K ,KANG S ,et al.Conserved nucle-osome positioning defines replication origins J .Genes &De-velopment ,2010,24(8:748-753.3赵宏宇,李珺,蔡禄,等.4种酵母基因组提取方法的比较J .食品科学,2011,32(9:170-173.4SAMBROOK J ,RUSSELL D W.Molec