食管癌患者外周血CK20、CK19、CEAmRNA的表达及其临床病理意义

1、食管癌患者外周血CK20、CK19、CEAmRNA的表达及其临床病理意义              作者：王景美，杜艳，郭英，吴平平，金月玲，田小强，黄培林 【关键词】  食管癌；逆转录聚合酶链反应；CK20；CK19；癌胚抗原；微转移摘要目的：研究89例食管癌患者外周血中CK20、CK19及CEA mRNA的表达，并探讨其临床病理意义。方法：巢式RTPCR技术检测89例食管癌患者术前外周血中CK20、CK19、CEA mRNA的表达。结果：89例食管癌患者外周血中

2、CK20、CK19及CEA的阳性表达率分别为49.44%、34.83%及52.81%；三基因同时检测时，至少1个基因检测结果为阳性的表达率为71.91，与食管癌的淋巴结转移和（或）远处转移具有相关性。结论：CK20、CEA可作为检测食管癌患者外周血微转移的生物学标志，RTPCR联合检测多种标志物可为了解肿瘤的恶性生物学行为、指导临床治疗方案的选择、判断预后及监测疗效提供依据。   关键词食管癌；逆转录聚合酶链反应；CK20；CK19；癌胚抗原；微转移   我国是世界上食管癌高发地区之一，食管癌的死亡率仅次于胃癌。近年来尽管手术切除率不断提高，但患者死亡率

3、仍居高不下，其原因为肿瘤的高复发和高转移率。研究表明，恶性肿瘤在侵袭和转移的早期阶段就可能有癌细胞进入血液循环，而患者常无任何临床表现，普通检测手段亦不能发现，即肿瘤微转移（micrometastasis）。若能及时检测循环血中的癌细胞，将对判断肿瘤的复发转移及指导临床治疗具有重要的价值。本研究应用巢式RTPCR技术联合检测89例食管癌患者外周血中组织特异性标志物CK20、CK19、CEA mRNA的表达，并探讨其临床病理意义。   1  资料和方法   1.1  一般资料随机选择东南大学附属中大医院和南京大学医学院附属鼓楼医院200

4、0年12月到2004年9月外科收治的食管癌患者89例，所有病例经术前病理确诊且尚未化疗，术前抽取外周血。另随机收集22名健康捐献者及27例非肿瘤患者（其中反流性食管炎患者14例、腐蚀性食管灼伤患者2例、贲门失弛缓症患者9例、食管憩室患者2例）外周血为阴性对照。15例食管癌肿瘤组织为阳性对照。食管癌患者组平均年龄62.6岁（3683岁），中位年龄65岁，男性62例，女性27例。阴性对照组平均年龄40.8岁（2471岁），男性30人，女性19人。收集食管癌患者临床病理资料，参照UICC(2002)标准进行TMN分期。   1.2  试剂及引物淋巴细胞分离液、DEPC购

5、自上海生工生物工程技术公司；Trizol Reagent为加拿大Sangon公司产品；逆转录PCR试剂盒及Taq酶等为TaKaRa公司产品；引物设计参照文献，由上海申友生物公司合成，见表1。   1.3  方法   1.3.1  样本处理及RNA提取  采集患者术前外周静脉血35ml，枸橼酸钠抗凝，2h内以Ficoll淋巴细胞分离法分离外周血单个核细胞（the peripheral blood mononuclear cells,PBMNC）。肿瘤组织以匀浆器研碎得细胞悬液。参照Trizol一步法提取细胞和组织的总RNA，无

6、RNA酶的DNase去除混杂的DNA，-80保存待用。表1  RTPCR反应引物序列及扩增产物   1.3.2  逆转录反应和PCR 扩增  取12g细胞总RNA，70 6min 变性后，根据TaKaRa 逆转录试剂盒进行cDNA 第1链合成。各取4l cDNA行第1轮PCR，取第1轮PCR反应产物0.5l行第2轮PCR，上、下游引物各20pmol，另有10×PCR Buffer、10mmolL-1dNTP、25mmolL-1MgCl2及Taq polymerase（0.625U）等，反应总体积25l。   1.3

7、.3  结果判断  取5 l第2轮PCR产物以1.8%琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，紫外灯下观察并拍照，在303、319、131及531bp处出现肉眼可见条带判为阳性。   1.4  统计分析用SPSS软件包分析各组数据，采用2检验及Fisher确切概率法，以P0.05为差异有显着性。   2  结   果89例食管癌患者及49例阴性对照组的外周血单个核细胞、15例食管癌患者肿瘤组织都扩增出了片段大小为531bp的内参对照actin，所有标本均进行CK20、CK19、CEA特异性巢式RTPCR扩

8、增，结果见图1。   2.1  CK20、CK19、CEA mRNA在肿瘤组织及阴性对照组的表达15例食管癌肿瘤组织中CK20、CK19和CEAmRNA均为阳性。22例健康捐献者外周血中有3例CEA阳性；非肿瘤患者外周血中有3例CK20阳性（2例反流性食管炎患者，1例腐蚀性食管灼伤患者），3例CK19阳性（腐蚀性食管灼伤、贲门失弛缓症、食管憩室患者各1例），3例CEA阳性（均为反流性食管炎患者）。   2.2  单基因检测结果与临床病理资料的相关性89例食管癌患者外周血中CK20、CK19和CEA mRNA的阳性率分别为49.44%（

9、44/89）、34.83%（31/89）和52.81%（47/89）。各基因RTPCR扩增结果见表1。表1  食管癌患者外周血中各基因表达情况统计分析表明，CK20 mRNA的阳性表达率与食管癌患者的年龄、性别、细胞分化、肿瘤浸润深度及淋巴结转移无关，而与肿瘤的远处转移具有相关性(P0.01)。CK19mRNA的阳性表达与患者上述所有的临床病理资料均无相关性(P0.05)。而CEAmRNA的阳性表达则与肿瘤的淋巴结转移及远处转移有关，差异具有统计学意义(P0.05及P0.01)。   2.3  多基因检测结果与临床病理资料的相关性如表2所示，本研究中，同

10、时检测CK20、CK19及CEA三基因的任意两基因时，至少1个基因检测结果为阳性的表达率为61.80% (55/89)66.29%(59/89)，其中CK20/CEA及CK19/CEA与远处转移具有相关性(P0.01)，CK20/CK19则与淋巴结转移具有相关性(P0.05)。三基因同时检测时，至少1个基因检测结果为阳性(CK20/CK19/CEA) 的表达率为71.91(64/89)，与肿瘤的淋巴结转移、远处转移具有相关性(P0.05)；8例三基因皆阳性表达(CK20+CK19+CEA) 者为晚期肿瘤患者，统计结果表明其与肿瘤远处转移具有相关性(P0.01)。患者的年龄、性别、肿瘤的细胞分化

11、及浸润深度与多基因检测结果均无相关性。表2  食管癌患者外周血多基因表达         3  讨   论近20年来肿瘤微转移已成为研究热点之一。肿瘤细胞在外周血中的微转移是肿瘤复发和转移的重要起始步骤，肿瘤细胞弥散入淋巴结、骨髓及外周血预示着患者生存时间的缩短。播散到外周血中的实体肿瘤细胞数目非常少，需要高度敏感、特异的技术对其进行检测，RTPCR技术具有高度的敏感性和特异性，被认为是目前检测外周血微转移的有效方法。许多学者对胃肠道癌、乳腺癌、胰腺癌等的研究结果表明，外周血

12、中循环癌细胞的检出与肿瘤的恶性生物学行为有相关性，并且是影响远期生存的独立因素，可为肿瘤病人合理治疗方案的制定及预后判断提供客观依据。CK20、CK19、CEA是国内外公认的、最常见的上皮性组织特异性标志物。细胞角蛋白（cytokeratins,CKs）是分布于上皮细胞的中间纤维，它含有20多种异构体，其表达方式反映了上皮细胞分化的不同途径。由于癌细胞大多保留起源细胞的CKs类型，由此便可通过测定CKs来决定癌细胞的起源。CK19、CK20可作为检测外周血中循环癌细胞的有效的生物标志物，主要用于检测胃肠道、乳腺、前列腺及肺的恶性肿瘤。CEA是一个广谱性肿瘤标志，几乎所有上皮组织及其起源的肿瘤组

13、织都可检测出CEAmRNA，而非上皮性细胞呈阴性表达。CEAmRNA阳性主要见于胃肠道肿瘤及乳腺癌、非小细胞肺癌等。Nishida等1认为RTPCR法检测外周血中的循环癌细胞的CEA可能是预测胃肠道癌术后有价值的标志物。我们对胃癌、肠癌、乳腺癌及肺癌患者术前外周血的研究也提示，CK20、CK19、CEA是检测上皮恶性肿瘤尤其胃肠道癌外周血微转移有潜力的生物学标志24。目前食管癌微转移方面的研究稍滞后于胃肠道癌。Osullivan等研究发现，50例食管癌患者肋骨骨髓微转移检出率为88%，髂骨骨髓仅为15%，并将肋骨骨髓中癌细胞成功接种于裸鼠皮下，说明食管癌患者循环中存在癌细胞。Thorban及M

14、acadam等67的研究表明，食管癌患者体内肿瘤细胞的血行播散发生在肿瘤进展的早期，骨髓中微转移的检出预示着术后早期的复发及转移。Natsugoe等以CEA特异性RTPCR检测了48例食管癌患者的骨髓，研究结果提示RTPCR结果阳性者的复发及存活率较阴性者差。Ito等的研究结果也表明，食管癌患者外周血循环肿瘤细胞的检出预示着肿瘤的早期复发。我们的研究结果表明，89例食管癌患者术前外周血中，CK20mRNA阳性表达的有44例（49.44%），CK19mRNA阳性表达的有31例（34.83%），CEAmRNA阳性表达的有47例（52.81%）。结合临床随访资料分析表明，CK20mRNA的阳性表达与

15、食管癌远处转移具有相关性(P0.01)；CEAmRNA的阳性表达则与食管癌的淋巴结转移及远处转移有关，差异具有统计学意义(P0.05及P0.01)；CK19mRNA的阳性表达则与所有的临床病理资料均无相关性(P0.05)。这些结果提示，CK20、CEA更适宜作为检测食管癌患者外周血微转移的生物标志物，术前外周血中CK20、CEAmRNA的阳性表达与食管癌的恶性生物学行为有关，联合检测可能有助于指导临床治疗及判断预后，这与国内外的相关报道类似。此外，在健康捐献者及非肿瘤患者外周血中也有CK20（3例）、CK19（3例）及CEA（6例）的阳性表达，可能为上皮细胞污染（常规静脉采血时）或者炎症时释放

16、的细胞因子诱导了血细胞中上皮性标志物的表达所致的假阳性，尚需增加对照组病例数以进一步证实。统计分析表明，阴性对照组与食管癌患者组相比较，外周血检测结果具有显着性差异(P0.01)。分析多基因检测结果与食管癌患者的临床病理资料，结果表明，同时检测CK20、CK19及CEA三基因的任意两个基因时，至少1个基因检测结果为阳性的表达率为61.80% (55/89)66.29%(59/89)，三基因至少1个基因检测结果为阳性(CK20/CK19/CEA) 的表达率达71.91(64/89)。与单个基因的检测结果相比，阳性率都有上升，提高了检测的敏感性。表3同时表明，联合同时检测多基因时，随着淋巴结转移和

17、（或）远处转移的发生，食管癌患者外周血中阳性表达率有上升趋势，且具有统计学意义。8例晚期食管癌患者外周血中同时表达CK20、CK19及CEAmRNA(CK20+CK19+CEA)，17例晚期食管癌患者外周血中CK20、CK19及CEAmRNA则至少1个基因为阳性表达(CK20/CK19/CEA)，而阳性对照的15例食管癌肿瘤组织均为三基因阳性表达，说明并非在所有已发生远处转移或术后复发的患者三基因的表达水平相同，即使在同一肿瘤中并非所有标志物的表达水平相似。单个基因检测时，如目的基因mRNA表达量少，极有可能导致检测结果的假阴性，如能同时检测多个基因，则可避免此种结果。而联合多种标志物、多时间

18、点检测，更能增加结果的准确性和可信性，尚需多时间点取材以及进一步增加病例数。本研究以RTPCR技术对89例食管癌患者外周血中CK20、CK19、CEAmRNA进行了检测，结果表明CK20、CEAmRNA的表达与食管癌的转移有很强的相关性，多基因联合检测可避免单基因造成的遗漏，可作为一种检测外周血循环癌细胞的有效方法，可进一步了解肿瘤的恶性生物学行为，有助于临床治疗方案的制定和预后评估，为指导制定个体化的合理综合治疗方案提供依据，并进一步支持了我们以前的研究成果10。   参考文献   1NISHIDA S,KITAMURA K,ICHIKAWA D,et

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