美国药典-USP-561-植物源性物质

第11页/共23页<561>植物源性物质抽样为了减少取样偏差对定性、定量结果的影响，就必须保证所抽样品的组成在该批药品中具有代表性。对于植物药来说，以下取样步骤是植物药取样的最低要求。某些品种或某些检测，需要更加严格的抽样步骤，包括从更多的容器中取样或从单个容器中取更多的样品。大批样品某批次样品的包装总数(N)需要抽检的包装数量(n)1～10全部11～1911＞19n=10+(N/10)(“四舍五入”计算“n”至邻近的最高位整数。)从每个包装的上部、中部、下部分别取样。如果样品由尺寸为1cm或者小于1cm的部分组成，以及由粉末或者研碎的小颗粒组成的样品，可借用取样装置取样，该装置能移取从包装的顶端至底部包括中心的一段，从不同的方向移取至少两次。如果样品尺寸大于1cm，手工取样。对于大捆或大包样品，应从样品10cm深处取样，因为表层样品的水分含量可能不同于内层。从每个开口包装取出单个的样品进行混合制成大批样品，务必不要增加样品的粉碎程度和显著改变其湿度。对于包装小于1kg的样品，将内容物混匀，并移取足够检测使用的样品。对于包装在1-5kg的样品，从包装的上、中、下部移取等量的样品，每一样品足够检测使用。充分混合样品，移取足够检测使用的样品。对于包装大于5kg的样品，从包装的上、中、下部移取三个样品，每个样品重量不得少于250g。充分混合样品，移取足够检测使用的样品。实验室样品实验室样品通过对大批样品进行重复四分法获得。注释—四分法包括准备试样、充分混合使之成均等的方形和按对角线平均分成四等份。取其中相对的两份，充分混合，按照上述步骤重复进行直至达到要求的量。平均试样必须有足够的量以完成所有必检项目。检测样品除非各论中或试验操作下另有说明，按以下方法获得试样：依据四分法缩小实验室样品的量，注意确保每份取出的部分具有代表性。对于非粉末或者非研碎的样品，研碎样品使之能通过20号标准筛，并充分混合均匀；如果样品不能被研碎，尽量研碎使样品呈现尽量细的状态，并混合，在纸上或者取样布上通过碾轧混匀样品，使之分散成一薄层，提取一部分作为分析备用。分析方法有机异物试样—除非各论中另有说明，称取下述质量的实验室样品，确保样品具有代表性(如有需要，可应用四分法取样)：根、茎、树皮和草药类5叶子、花、种子和果实2切碎的植物药(平均片重不低于0.5g)5将样品平铺分散成一薄层，尽量用手工挑选出全部有机异物。称重，计算有机异物占所取样品的质量百分比。总灰分精确称定一定量检测样品(相当于2～4g经空气干燥的样品)于去皮重的坩埚中，灼烧，开始用小火，逐渐升高温度至675±25°，直至完全灰化，称灰分的重量。如果这种方法不能得到无碳灰分，用热水提取焦化的物质，收集不溶性残渣于一张无灰滤纸上进行过滤，灼烧不溶性残渣和滤纸直至使灰分变为白色或者近白色，然后将滤液加入，蒸发至干，一起置于675±25°下灼烧。如果这种方法亦不能得到无碳灰分，冷却坩埚，向其中加入15mL乙醇，玻璃棒捣碎灰分，蒸干乙醇，再次置于675±25°下灼烧。置于干燥器内冷却，称重灰分，计算总灰分占所取药品重量的百分含量。酸不溶性灰分向按上述总灰分中的指示操作得到的灰分中加入25mL3N盐酸，煮沸5分钟，用去皮重的过滤坩埚或者无灰滤纸收集不溶性物质，热水洗涤，灼烧，并称重。计算酸不溶性灰分占所取药品重量的百分含量。水溶性灰分按总灰分中的指示制备灰分，向其中加入25mL水，煮沸5分钟。用热压结玻璃坩埚或者无灰滤纸收集不溶物。热水洗涤，在不超过450°下灼烧15分钟。用总灰分减去灼烧残渣的质量(mg)，计算水溶性灰分占总灰分项下测得的样品质量的百分含量。醇溶性浸出物方法1(热浸提法)—精确称定4g风干的样品粗粉，置于一具塞锥形瓶中，加入100mL乙醇，并称重锥形瓶，摇匀，静置1h后，接上回流冷凝管，水浴加热回流1h，冷却，称重，用乙醇调整其质量等于初始质量，摇匀，用一干燥的过滤器迅速过滤，取滤液25mL置于一事先恒重的表面皿，水浴蒸干，105°干燥6h，置于干燥器冷却30min，并立即称重。计算醇溶性提取物质占试验样品的比例，以mg/g表示。方法2(冷浸提法)—精确称定4g风干的样品粗粉，置于一具塞锥形瓶中。加入100mL乙醇，向锥形瓶内放入一塞子，浸提24h，前8h不时振荡锥形瓶，静置。快速过滤，注意乙醇的挥发损失。移取25mL滤液置于事先恒重的平底浅平皿中，蒸干溶剂，于105°烘干至恒重。计算醇溶性物质占试验样品的比例，以mg/g表示。水溶性浸出物方法1(热浸提法)—按照醇溶性浸出物中的方法1(热浸提法)步骤处理，溶剂以水代替醇即可。方法2(冷浸提法)—按照醇溶性浸出物中的方法2(冷浸提法)步骤处理，溶剂以水代替醇即可。粗纤维称取一定量(相当于2g药物)的检测样品用乙醚处理(挥干乙醚)。在一500mL烧瓶内，向该无醚样品中加入200mL沸腾的稀硫酸溶液(1:78)，接上回流冷凝管。回流混合物30min，准确计时，然后用亚麻布或者硬纸过滤器过滤，用沸水洗涤滤纸上的残渣，直至流出液不呈酸性为止。再用200mL沸腾的氢氧化钠溶液(通过滴定调节浓度至1.25%，且不含碳酸钠)将残渣洗回烧瓶内。回流30min，准确计时，用已去皮重的滤器快速过滤，用沸水洗涤滤纸上的残渣，直至最后的流出液为中性，将滤纸和残渣置于110°干燥至恒重。灼烧干燥残渣至恒重，在干燥器中冷却，称重灰分：110°在干燥得到的质量和灰分质量的差值即为粗纤维的质量。注释—从液体(通过将液体加入冷的烧瓶，使其温度降至沸点以下)再次沸腾开始，酸碱须持续沸腾30min，准确计时。液体沸腾后，应该降低加热温度，只要能保证烧瓶内液体持续沸腾即可。沸腾期间须不时轻轻地旋转烧瓶，洗下附着在烧瓶壁的微小颗粒。在沸腾过程中，如果泡沫过多，可向烧瓶内通入空气。淀粉含量方法1—以下步骤是测定总还原糖的一般方法并可能用于确定植物性样品中的淀粉含量。麦芽提取物—使用具有确定效能的新鲜大麦麦芽，临用前研磨。临用前制备麦芽提取物。每制备80mL麦芽提取物，需将5g磨碎的麦芽用100mL水在室温消化2h。[注释—如果用电动搅拌器，搅拌混合物20min即可。]过滤得澄清提取液，如有需要再过滤，混匀浸出液。供试溶液一称取约5g充分磨碎的样品，用10mL乙醚提取5次，用能截留所有细小淀粉颗粒的过滤皿过滤，蒸发除去残留物中的醚，用250mL乙醇水溶液(10mL乙醇用水定容至100mL)洗涤。用约100mL水小心将滤纸上的残渣洗脱至500mL大口烧杯中，加热至60°(尽可能避免淀粉加热糊化)，维持1h，这期间不停地搅拌使糖类能完全溶解形成溶液。转移至一广口瓶中，用少量温水洗涤，冷却。加入等体积的乙醇，混匀，放置1h以上。离心使沉淀聚集至瓶底，轻轻倒出上层清液。用50mL乙醇溶液(50mL乙醇用水定容至100mL)连续洗涤，并离心，倾出液通过适当的过滤器，直到滤出液无糖为止。[注释—为了检验是否含糖，可向试管中滴加几滴洗出液，并加入3~4滴20%的1-萘酚乙醇溶液，200mg1-萘酚溶解于1mL乙醇和2mL水即得20%的1-萘酚乙醇溶液。摇匀混合液，沿着试管壁加入2～4mL浓硫酸，保持试管竖直放置。如果洗涤液含糖，两液体的界面处出现淡紫色并逐渐变为深紫色，振荡试管，整个溶液呈现蓝紫色。]将瓶底和硬纸滤纸的沉淀用50mL水转移至一大口烧杯中，将烧杯浸入沸水浴，并搅拌，维持15min，或者直到所有的淀粉糊化，冷却至55°，加入20mL麦芽提取物，在此温度下维持1h。继续加热至沸腾，并维持几分钟，冷却至55°，再加入20mL麦芽提取物，在此温度下维持1h或者直到残留物加入碘TS，显微镜观察不再显示蓝色为止。冷却，用水稀释淀粉水解液至250mL，过滤。一般步骤—移取200mL供试溶液置于烧瓶(连有回流冷凝管)内，加入20mL盐酸，沸水浴上加热2.5h。冷却，用氢氧化钠TS中和至近中性，并用碳酸钠TS中和至完全中性，用水稀释至500mL，混匀，过滤。移取滤液的体积取决于待测样品中淀粉的含量(参见表1)。所取滤液需含有100mg~200mg的葡萄糖。移取50mL滤液至一400mL耐碱玻璃烧杯中，加入50mL碱性酒石酸铜TS，用玻璃表面皿盖住烧杯，加热。调整电炉的温度，使烧瓶内的液体在4min内开始沸腾，并精确持续沸腾2min。用热压结的玻璃滤器过滤该热溶液。用约60°水彻底洗涤漏斗内氧化亚铜沉淀，再用10mL乙醇洗涤，最后用10mL乙醚洗涤。表1最适宜的滤液体积的确定预计的淀粉含量，%所取滤液体积，mL60255035405030502050如果溶液还原糖纯度比较高，按照方法1A项下所示操作，通过称重干燥氧化亚铜的质量来计算被还原的铜的量；如果溶液中还原糖混有大量的有机杂质，包括蔗糖，按照方法1B项下所示操作，通过硫代硫酸钠溶液滴定计算被还原的铜的量。方法1A—将一般步骤中获得的沉淀在110±2°烘箱中干燥30min，置于干燥器中冷却至室温，称重，参照表2，依据氧化亚铜的质量找到对应的葡萄糖含量(mg)，计算葡萄糖的百分含量并按下式计算淀粉含量。淀粉含量(%)=葡萄糖%×0.9表2计算的葡萄糖(当Cu2O直接称重时适用)(单位mg)104.09038.917075.1250112.8330152.2410193.7124.99239.817276.0252113.7332153.2412194.7145.79440.617476.9254114.7334154.2414195.8166.69641.517677.8256115.7336155.2416196.8187.59842.417878.8258116.6338156.3418197.9208.310043.318079.7260117.6340157.3420199.0229.210244.218280.6262118.6342158.3422200.12410.010445.118481.5264119.5344159.3424201.12610.910646.018682.5266120.5346160.3426202.22811.810846.918883.4268121.5348161.4428203.33012.611047.819084.3270122.5350162.4430204.43213.511248.719285.3272123.4352163.4432205.53414.311449.619486.2274124.4354164.4434206.53615.211650.519687.1276125.4356165.4436207.63816.111851.419888.1278126.4358166.5438208.74016.912052.320089.0280127.3360167.5440209.84217.812253.220289.9282128.3362168.5442210.94418.712454.120490.9284129.3364169.6444212.04619.612655.020691.8286130.3366170.6446213.14820.412855.920892.8288131.3368171.6448214.15021.313056.821093.7290132.3370172.7450215.25222.213257.721294.6292133.2372173.7452216.35423.013458.621495.6294134.2374174.7454217.45623.913659.521696.5296135.2376175.8456218.55824.813860.421897.5298136.2378176.8458219.66025.614061.322098.4300137.2380177.9460220.76226.514262.222299.4302138.2382178.9462221.86427.414463.1224100.3304139.2384180.0464222.96628.314664.0226101.3306140.2386181.0466224.06829.214865.0228102.2308141.2388182.0468225.17030.015065.9230103.2310142.2390183.1470226.27230.915266.8232104.1312143.2392184.1472227.47431.815467.7234105.1314144.2394185.2474228.37632.715668.6236106.0316145.2396186.2476229.67833.615869.5238107.0318146.2398187.3478230.78034.416070.4240108.0320147.2400188.4480231.88235.316271.4242108.9322148.2402189.4482232.98436.216472.3244109.9324149.2404190.5484234.18637.116673.2246110.8326150.2406191.5486235.28838.016874.1248111.8328151.2408192.6488236.3方法1B—硫代硫酸钠溶液—称取3.9g硫代硫酸钠，精密称定，至100mL容量瓶中，用水溶解并定容至刻度线，混匀。碘化钾溶液—称取42g碘化钾，溶解于100mL水中。乙酸钠溶液—称取5.74g乙酸钠，溶解于10mL水。铜溶液—称取约0.3g纯电解铜，精密称定，置于250mL烧瓶，加入5mL硝酸溶解铜，加入约25mL水，加热沸腾排去红色烟雾。加入5mL溴TS，煮沸直至完全除去溴。冷却后，加入10mL乙酸钠溶液，然后再加入10mL碘化钾溶液，用硫代硫酸钠溶液滴定至溶液呈亮黄色。接着加入足够的淀粉TS，使之呈现显著的蓝色，并继续滴定，临近滴定终点时，加入2g硫氰酸钾固体，搅拌至完全溶解，继续滴定至沉淀物完全变白为止。每mL硫代硫酸钠溶液相当于约10mg铜。[注释—须小心调整碘化钾溶液的浓度。如果滴定结束时溶液所含的铜小于320mg，加入4.2～5g碘化钾制成总体积为100mL的溶液；如果有过量的铜存在，用滴定管缓慢加入碘化钾溶液，并不断搅拌，逐渐增大搅拌速率。]步骤—用水洗涤一般步骤中得到的氧化亚铜沉淀，用玻璃表面皿盖住过滤器，用吸量管吸取5mL硝酸溶解氧化亚铜于玻璃表面皿中，收集滤液于250mL烧瓶中，用水洗涤玻璃表面皿和过滤器，收集洗涤液于烧瓶中。煮沸烧瓶内的液体去除红色烟雾，加入约5mL溴TS，煮沸直至完全除去溴。冷却后，从“加入10mL乙酸钠溶液”处开始，按照铜溶液方法处理。根据消耗的硫代硫酸钠溶液体积，计算铜的质量(mg)，乘以1.1259得到氧化亚铜的质量(mg)。参照表2，找到对应的葡萄糖的质量(mg)，淀粉的质量(mg)相当于葡萄糖质量乘以0.9。以加入50mL碱性酒石酸铜TS和50mL麦芽提取物做空白对照试验，如果得到的氧化亚铜超过0.5mg，相应的校正结果。[注释—碱性酒石酸铜TS长期存放后会变质，导致空白对照试验中得到的氧化亚铜质量增加。]方法2—下述方法以葡萄糖为例，因为葡萄糖的高灵敏性，可能会引起同一种样品得到不同的数值。重复试验结果的误差不得超过2%。葡萄糖糖化酶溶液—制备每毫升含30个国际单位(IU)的葡萄糖糖化酶溶液，糖化酶的最佳来源为德氏根霉。所用样品的葡萄糖糖化酶总酶活性应不低于150IU。乙酸盐缓冲溶液—用100mL水溶解16.4g乙酸钠，加入12.0mL冰乙酸，混匀即可，该溶液的pH为4.8。磷酸盐缓冲液—将3.63g三羟甲基氨基甲烷和5.0g磷酸二氢钠溶解于50.0mL水中。37°下，用磷酸调节溶液的pH为7.0，并用水稀释至100.0mL，混匀。[注释—磷酸缓冲液的pH对温度敏感，须在孵育温度调节缓冲溶液的pH。]酶溶液—溶解30mg葡萄糖氧化酶(黑曲霉Ⅱ型酶)，3mg过氧化物酶(辣根过氧化物酶=1\*ROMANI型)和10mg亚铁氰化钾于100mL磷酸缓冲液中(注释—该混合物可在冰箱中保存10天。)18N硫酸溶液—将54mL浓硫酸缓慢加入102mL水中，并不断搅拌，冷却至25°，混匀。标准溶液—精密称定一定量的USP葡萄糖RS，溶解于水中，配成每毫升含有1.0mgUSP葡萄糖RS的溶液。用水将已知体积的该溶液定量稀释以制备一系列已知浓度的标准溶液A、B、C、D和E，每mL标准稀释液含有的USP葡萄糖RS分别为10、20、25、40和50μg。[注释—临用前允许4h待其发生完全变旋作用。]供试溶液—称取约5g充分磨碎的供试样品，用25mL80%乙醇提取五次，过滤，将残渣置于105°烘箱中干燥8h以完全除去残留的乙醇。[注释1—任何痕量的乙醇残留将会抑制葡萄糖糖化酶活性。]冷却，将含有干燥供试品的烧瓶置于干燥器内。称取1g供试品，精密称定，置于事先干燥恒重的烧瓶，加入25mL水，用磷酸调节pH值为5.0～7.0，如果需要，煮沸悬浮液3min。然后将烧瓶转入高压锅内，135°持续2h。从高压锅取出烧瓶，保持烧瓶温度在55°左右，加入2.5mL乙酸盐缓冲溶液和足量的水，调节烧瓶内溶液的总质量为45±1g。55±1°水浴加热，并加入5mL葡萄糖糖化酶溶液。烧瓶持续涡旋振荡2h使淀粉水解，用滤纸过滤至250mL容量瓶，用一定量水洗涤，洗涤液一并转入容量瓶，用水定容至刻度线，混匀。分别向5支试管中移取1mL供试液(含有20～60μg的D-葡萄糖)。[注释2—为了使水解产物的D-葡萄糖浓度在此范围，如有必要，用水将供试液定量稀释定容。]分别向5支试管中加入2mL酶溶液，并将试管置于暗处，37±1°温度下，准确放置30min显色。30min结束时，再分别向5支试管中加入2mL18N硫酸溶液终止反应，并混匀。对照溶液—称量约0.4g淀粉，精密称定，置于一事先恒重的烧瓶，从“加入25mL水，并用磷酸调节pH”处开始按照供试溶液中的指示操作。步骤—选用适当的分光光度计，连续地在最大波长处(约540nm)测定标准溶液和供试溶液的吸光值，并以对照溶液为空白校正仪器。以吸光值和标准溶液中葡萄糖溶液的浓度(μg/mL)绘制直线，使该直线能很好的拟合这5个点。根据绘制的标准曲线，确定各供试溶液中葡萄糖的浓度C(μg/mL)，计算待测溶液的平均浓度(μg/mL)。根据下面方程计算供试样品中淀粉含量：(0.9C/106)(V1)(250/V0)(100/E)(100/W)=2.25CV1/V0式中，E为所取供试样品的质量，g；V0为从250mL容量瓶中所移取的体积；W为供试样品干重的质量百分比；V1为供试溶液的体积，mL，如有稀释(见供试溶液中的注释2)。[注释—如果没有再稀释，V0=1.0]挥发油含量测定将一圆底短颈1L烧瓶固定于放在磁力搅拌器上的加热套内，并在烧瓶内放一卵形搅拌转子，接上指型冷凝管和合适的挥发油收集器，如图示。挥发油装置的管子粗略地粉碎足够量的待测药品，使其能产生1～3mL挥发油。小的种子、果实、或者破碎的叶子和药草通常不需要粉碎。要避免样品颗粒非常细，如果不可避免，可以混入经纯化的锯末屑或者沙子。将适量的药品，精确称定，置于烧瓶内，加入一半体积的水，接上冷凝管和合适的分离器，加热烧瓶至微沸并保持2h，或者直到药品中的挥发油完全被蒸馏出，分离器中的刻度管体积不再增加为止。如果已经从分离器的刻度管中获得一定量的挥发油，可从刻度管中读数，能精确至0.1mL。可以计算出100g药品中挥发油的含量。对于“密度比水重的挥发油”的分离器刻度管，油在冷凝水的下部，会自动流回烧瓶内。水分含量对于未研碎或非粉末状的药品，通过剪切、打粉或者切碎制备约10g实验室样品，使其破碎部分约为3mm厚。对于小于3mm的种子和果实需要粉碎。样品制备时避免使用高转速的磨碎机，且样品制备过程中还要注意避免大量水分的损失以及所取样品具有实验室样品代表性。按照水分测定<921>项下的方法Ⅲ(重量法)中的植物源性药品的操作步骤测定水分含量。黄曲霉毒素的检测注意—黄曲霉毒素危险性很高，在处理含有黄曲霉毒素的样品时须极其小心。如果各论中要求黄曲霉毒素的顺应性限量，则黄曲霉毒素B1（AFB1）不超过5ppb，黄曲霉毒素B1（AFB1）,B2(AFB2),G1(AFG1)和G2(AFG2)总和不超过20ppb。测试中可能采用存在污染风险的方法。测定黄曲霉毒素的顺应性时将考虑存在的意外污染。以下分析步骤用于测定顺应性。除非各论中另有说明，按方法Ⅰ。如果方法不合适，按方法Ⅱ或方法Ⅲ。方法ⅠTLC测试法用于测定任何植物源性物质中可能存在的AFB1,AFB2,AFG1和AFG2。乙酸锌-氯化铝试剂—用足量的水溶解20g乙酸锌和5g氯化铝，定容至100mL。氯化钠溶液—溶解5g氯化钠于50mL水中。供试溶液1—研磨约200g植物性样品至精细的粉末。称取约50g该粉末状样品，精确称定，置于一具玻璃塞烧瓶中。加入约200mL甲醇-水(17：3)的混合液。用机械方法强烈振摇烧瓶至少30min，并过滤。[注释—如果溶液干扰植物色素，参照供试溶液2方法处理。]弃除初滤液50mL，并收集续滤液40mL。将续滤液转移至一分液漏斗中。加入40mL氯化钠溶液和25mL正己烷溶剂，振摇1min。静置使液面分层，分离下层水相至另一分液漏斗中，每次用25mL二氯甲烷萃取分液漏斗中的水相，并振摇1min，萃取2次。每次使液面分层，分离下层有机相，收集合并后的有机相，置于一125mL锥形瓶中。水浴上蒸干有机溶剂。移取剩下的萃取物至合适的试管，水浴蒸干，冷却残渣。如果残渣中有干扰物存在，按照供试溶液2中的净化步骤处理；否则，用0.2mL氯仿-乙腈(9.8：0.2)混合液溶解上述残渣，如有需要，用机械方法振荡溶解。供试溶液2—参照上述流程收集100mL滤液，转移至250mL烧杯中。加入20mL乙酸锌-氯化铝试剂和80mL水。搅拌，静置5min。加入5g适当的过滤助剂，例如硅藻土，混匀，过滤。弃除初滤液50mL，并收集续滤液80mL。从“将续滤液转移至一分液漏斗中”步骤开始按照供试溶液1中的步骤操作。净化步骤—将多孔介质的热压结玻璃盘或者玻璃棉固定在10mm×300mm柱子的底端。将2g硅胶与乙醚-正己烷(3：1)混合液混合制成浆状液，装柱，并用5mL乙醚-正己烷(3：1)混合液淋洗柱子，放置使吸收剂沉降。从柱子顶端加入1.5g无水硫酸钠，形成一薄层。用3mL二氯甲烷溶解上述步骤制备的残渣，并转移至柱子中，用1mL二氯甲烷洗涤烧瓶2次，将洗涤液也一并转移至柱子中，以不超过1mL/min的流速洗脱柱子；继续向柱子中加入3mL正己烷、3mL乙醚和3mL二氯甲烷，以不超过3mL/min的流速洗脱柱子；弃去洗脱液，向柱子中加入6mL二氯甲烷-丙酮混合液(9:1)，以不超过1mL/min的流速洗脱柱子，最好不用真空辅助洗脱。用小瓶收集洗脱液，如有必要，加入沸石，水浴挥干溶剂，残渣用0.2mL氯仿-乙腈(9.8：0.2)混合液溶解，如有必要，可用机械装置振摇帮助溶解。供试溶液3—如果残渣中干扰物仍然存在，按照方法Ⅱ中供试溶液中IAC的净化步骤操作。黄曲霉毒素溶液—[注意—黄曲霉毒素具有极高毒性。小心操作。]用乙腈稀释黄曲霉毒素RS1:5，得到AFB1和AFG1的浓度分别为0.4ug/ml，AFB2、和AFG2的浓度分别为0.1ug/ml。步骤—分别将2.5μL、5μL、7.5μL、10μL黄曲霉毒素溶液和3个10μL供试溶液1或者供试溶液2或供试溶液3点在铺有0.25mm厚色谱硅胶混合物的薄层色谱板(见色谱法<621>)上，在其中一个供试溶液点样孔中再点5μL黄曲霉毒素溶液。待点样孔干后，置于装有氯仿、丙酮、异丙醇(85：10：5)的不饱和层析缸里展开，直到溶剂前沿距原点不小于15cm。将硅胶板从层析缸中取出，标记溶剂前沿，使硅胶板风干，在紫外灯365nm处观察薄层板上的斑点。方法适用性—黄曲霉毒素溶液中的四个成分在板上显示四个分离的蓝色荧光斑点。对于再点加黄曲霉毒素溶液的供试溶液孔，其斑点强度不如相对应的黄曲霉毒素溶液孔高。可接受标准—与再点加黄曲霉毒素溶液的孔相比较，其他供试溶液孔中与之对应的地方没有斑点。如果供试溶液孔显示黄曲霉毒素斑点，比对各供试溶液的荧光斑点位置与黄曲霉毒素溶液孔的荧光斑点位置，可鉴定该供试液中含有该种黄曲霉毒素。通过比较供试溶液孔与黄曲霉毒素溶液孔中斑点的荧光强度，可以确定供试溶液中黄曲霉毒素的大概浓度。如果各论中要求黄曲霉毒素的顺应性限量，黄曲霉毒素AFB1不超过5ppb，黄曲霉毒素AFB1，AFB2,AFG1和AFG2之和不超过20ppb，除非另外说明。方法Ⅱ氯化钠溶液—查看方法Ⅰ。磷酸盐缓冲溶液—10mM磷酸盐缓冲溶液的制备：0.138M氯化钠水溶液和0.0027M氢氧化钠水溶液混合，2M氢氧化钠溶液调节pH为7.4。免疫亲和性柱子（IAC）—条件形成之前先调节IAC至室温。10mL磷酸盐缓冲溶液在重力作用下2~3mL/min流经柱子，使用供试溶液前，在柱子上剩余0.5mL磷酸盐缓冲溶液。供试溶液—样品萃取物—精确称取5g具有代表性的粉末样品，置于一带有玻璃塞的烧瓶中。加入20mL甲醇—水（17:3）的混液，用机械方法强烈振摇至少30min，并过滤。弃除5mL初滤液，并收集4mL续滤液。将续滤液移至一分液漏斗，加入4mL氯化钠溶液和2.5mL正己烷溶剂，振摇1min。静置使液面分层，分离下层水相至另一分液漏斗中，每次用2.5mL二氯甲烷萃取分液漏斗中的水相，并振摇1min，萃取2次。每次使液面分层，分离下层有机相，收集合并后的有机相，置于一50mL锥形瓶中。水浴蒸干有机溶剂。移取剩下的萃取物至合适的试管，水浴蒸干，冷却残渣。如果残渣中有干扰物存在，按照IAC净化步骤处理；否则，用200μl乙腈溶解上述残渣，如有需要，用机械方法振摇溶解。IAC净化步骤—用5mL甲醇—水（60:40）混液溶解残渣并用5mL水稀释。样品萃取物流经已优化的柱子。用10mL的磷酸盐缓冲溶液冲洗IAC两次，并用2mL甲醇缓慢洗脱。充入氮气使剩余洗脱液蒸发，并用200μl乙腈溶解残渣。黄曲霉毒素溶液—[注意—黄曲霉毒素具有极高毒性。小心操作。]用乙腈稀释一定量的USP黄曲霉毒素RS1:5，得到AFB1和AFG1的浓度分别为0.04ug/ml，AFB2、和AFG2的浓度分别为0.01ug/ml。分析—分别将5μL、7.5μL、10μL黄曲霉毒素溶液和10μL供试溶液点在铺有200μm厚色谱硅胶混合物的HPTLC(见色谱法<621>)板上，在其中一个供试溶液点样孔中再点5μL黄曲霉毒素溶液。待点样孔干后，置于装有氯仿、丙酮、异丙醇(140：20：0.3)的不饱和层析缸里展开，直到溶剂前沿距原点不小于7.2mm(距板较低边沿80mm)。将硅胶板从层析缸中取出，标记溶剂前沿，待硅胶板风干5min，荧光（>400nm）扫描，紫外灯366nm处观察薄层板上的斑点。对照黄曲霉毒素溶液鉴别供试溶液中出现的每个斑点对应的黄曲霉毒素种类。供试溶液中黄曲霉毒素的浓度可以根据由黄曲霉溶液的扫描数据得到的标准曲线计算得出。方法适用性—黄曲霉毒素溶液中的四个成分在板上显示四个分离的蓝色荧光斑点。对于再点加黄曲霉毒素溶液的供试溶液孔，其斑点强度不如相对应的黄曲霉毒素溶液孔高。此方法得到已失效的AFB1和AFG1回收率不低于70%。可接受标准—当各论中要求黄曲霉毒素的顺应性限度时，黄曲霉毒素AFB1不超过5ppb，黄曲霉毒素AFB1，AFB2,AFG1和AFG2之和不超过20ppb，除非有另外说明。方法Ⅲ该测试方法被作为实例用于检测AFB1和总的黄曲霉毒素（AF:AFB1,AFB2,AFG1和AFG2之和）是否存在，并已证明适用于人参和生姜粉末，必须经过证明判断是否适用其他植物源性药物。0.1M磷酸盐缓冲溶液—用800mL水溶解8.69g无水磷酸氢二钠和4.66g无水磷酸二氢钠或用800mL水溶解5.36g磷酸二氢钠水合物，再用2M氢氧化钠溶液调节pH为7.4，加入10mL聚山梨酯20，稀释至1L。磷酸盐缓冲溶液—按照方法Ⅱ制备。黄曲霉毒素工作标准溶液-根据表3分别使用10-ml容量瓶制备6个溶液。用甲醇和水（1:1，V/V）稀释至刻度。储藏于冰箱，使用前平衡至室温。当天制备溶液。表3各黄曲霉毒素工作标准溶液黄曲霉毒素工作标准溶液USP黄曲霉毒素RS(ul)黄曲霉毒素工作对照溶液最终黄曲霉毒素浓度（ng/ml）AFB1AFB2AFG1AFG210000006250.250.06250.6253250.50.1250.50.1251.2545010.2510.252.5510020.520.556200414110免疫亲和性柱子（IAC）2使用一装有单克隆抗体与AFB1，AFB2，AFG1和AFG2会产生杂交反应的免疫亲和性柱子。这种免疫亲和性柱子对黄曲霉毒素的最小容量不少于100ng，当AFB1，AFB2，AFG1和AFG2各5ng混合在10mL10%甲醇的磷酸盐缓冲溶液（v/v）时，AFB1，AFB2，AFG1和AFG2的回收率不小于80%。供试溶液萃取物—称取5g具有代表性的试样于50mL离心管中。加入1g氯化钠和25mL甲醇和0.5%氢氧化钠的混液（700:300，v/v）。用涡旋混合器混合，直至样品微粒和萃取溶剂混合充分。400rpm下振摇10min。7000rpm下离心10min（重力加速度g=5323mm/s2）或以能致使残渣成坚硬球状的速度离心。快速用移液管移取7mL上层液体于50mL的离心管，加入28mL0.1M的磷酸盐缓冲溶液，混匀，并用玻璃微纤维纸过滤。用25mL的量筒收集25mL滤液，并迅速用IAC色谱法分析。IAC的净化—[注释—使用前柱子必须保持室温至少15min。]取下顶部的柱帽，并与贮液器连接；取下底部的柱帽，并与歧管连接（接口处必须紧密）。让液体流经柱子，直到液体离柱床约2~3mm时，贮液器中加入25mL滤液。滤液在重力作用下流经柱子，直至流干。为了滤液下一次能容易地在柱子里开始流动，将柱子从歧管上拆下，柱子中加入约2mL的磷酸盐缓冲溶液，将柱子重新与贮液器连接，另外添加3mL磷酸盐缓冲液冲洗柱子，然后用5mL水冲洗（如果用其他方法可以驱赶柱子底部的气泡并使滤液下一次能容易地在柱子里开始流动，那么5mL磷酸盐缓冲液可以直接加入柱子的贮液器中。）。待柱子内液体流干，用注射器射入3mL空气。用1mL甲醇洗脱柱子，使洗脱液自由地滴落，并收集在3mL的容量瓶中作为分析物。待柱子内液体流干，并保持1min，然后用另外1mL甲醇洗脱，并收集在同一个容量瓶中，待柱子内液体流干，射入10mL空气流经柱子，用水稀释至容量瓶刻度。将收集并稀释后的洗脱物作为供试溶液，并立即进行黄曲霉毒素分析的操作。系统适用性溶液通过加入5ml黄曲霉毒素工作标准溶液5至一5g样品中制备加标样品，对供试溶液重复此操作，使用20ml替代25ml甲醇和0.5%碳酸氢钠的混合物（700:300）。色谱条件流速：0.8mL/min检测：荧光检测器，激发波长362nm，发射波长440nm。柱子：L1填充柱（4.6-nm×15-cm,3μm）。流动相：等度洗脱使用光化学灯置后衍生化：水，甲醇，乙腈（600：250：150，v/v/v）。使用电化学溴化灯置后衍生化：1L水，甲醇，乙腈（600:250:15,v/v/v），350mL4M硝酸和120mg溴化钾的混合溶液。置后衍生化系统—PHREDCELL：使用光化学灯3置后衍生化。KOBRACELL：使用装有电化学溴化灯4置后衍生化。分析黄曲霉毒素的置后衍生化—使用一紫外灯或电化学溴化灯。进样50μL试剂空白（黄曲霉毒素标准工作溶液1）黄曲霉毒素标准工作溶液2-6或供试溶液于液相色谱柱中。通过比较标准工作溶液的保留时间辨别供试溶液中黄曲霉毒素的峰。黄曲霉毒素按照AFG2，AFG1，AFB2和AFB1的顺序洗脱出来。穿过光化学灯或电化学溴化灯后，AFG1和AFB1衍生形成AFG2a（AFG1为衍生物）和AFB2a（AFB1为衍生物）。[注释—衍生物的化学结构经过电化学溴化作用和光化学作用后不同。AFB1和AFG1光化学作用后的产物结构不确定。]使用光化学灯衍生化后AFG2，AFG2a，AFB2，AFB2a的保留时间大概在14~27min之间；使用电化学溴化灯衍生化的保留时间更短。峰面积由基线决定，建立每种黄曲霉毒素的标准曲线。通过标准曲线计算供试溶液中各种黄曲霉毒素的浓度。黄曲霉毒素标准曲线—标准曲线根据包含四种黄曲霉毒素的黄曲霉毒素标准工作溶液建立，为各种黄曲霉毒素做准备。这些溶液包括0.25~4ng/mL的AFB1和AFG1，0.0625~1ng/mL的AFB2和AFG2。在分析前依据表3建立标准曲线，并验证曲线的线性。如果测试部分的面积响应值超出（较高）曲线范围，那么供试溶液需要用甲醇和水的混液（1:1，v/v）稀释并重新测定。系统适用性AFB1(2ug/kg)和黄曲霉毒素总量（5ug/kg）的平均加标回收率分别不得少于68%和70%。AFB1和黄曲霉毒素总量的相对标准偏差（RSD）不得过10%。计算以每种毒素标准溶液的峰面积为y轴，浓度为x轴绘制曲线，确定斜率（S）和截距（a），按照下面的式子计算样品中毒素的浓度。毒素浓度（μg/kg）={[(R-a)/S]×V/W}×F式中R为供试溶液峰面积；V为供试溶液的最终进样体积（mL）；F为稀释因子。当V=3mL时F=1。W为1g流经免疫亲和性柱子的试样。黄曲霉毒素的总量为AFG2，AFG1，AFB2，AFB1之和。可接受标准如果各论中要求黄曲霉毒素的顺应性限量，黄曲霉毒素AFB1不超过5ppb，黄曲霉毒素AFB1，AFB2,AFG1和AFG2之和不超过20ppb，除非另外说明。农药残留分析定义本药典中所指的农药是指用于阻止、破坏或者控制任何害物的植物或动物的物质或物质的混合物，这些植物、真菌或动物会在纯物品的生产、加工、储存、运输或销售过程中产生危害或干扰这些过程。所指农药包括用作生长调节剂，脱叶剂，或干燥剂的物质，和用于农作物收获前或后防止在贮存和运输中变质的任何物质。限度在美国，许多植物性药材被作为食品补充剂，根据联邦食品、药品和化妆品法案依法供给，这些法案只负责管理食品而非药品。食品中的农药限量由美国环境保护局(EPA)按照联邦管理法规（40CFRPart180）或联邦注册(FR)制定。此外，FDA还设定了不可避免农药残留的活动水平（21CFR109和209部分）。对于农药化学药品如果EPA没有设置容许量或FDA未设定活动水平，其残留应低于指定方法的检出限。如果其结果小于EPA测定的，其限量值为0。在美国，当植物源性药品注明用于食品时，这里所包含的限量不能适用。然而，这里所包含的限量也许能使用于允许这些农药残留的其他国家。除非各论中另有说明，所测物质中含有的任何农药的数量不得高于表4所列限度。对于没有列于表4中，而由于某些原因怀疑其存在的农药，其限度必须符合EPA中规定。如果表4和EPA规定中未列出农药的限量，按下式计算其限量：限度（mg/kg）=AM/100B式中，A为每日允许摄入量(ADI)，发布于FAO-WHO，mg/(kg体重)；M为体重，kg（60kg）；B为该物质的每日摄入量，kg。如果该物质是用来制备提取物、酊剂或者其他药物形式，则应根据其制备方法的差异修正成品中农药的含量，按以下公式计算其限量：限度（mg/kg）=AME/100B式中E为农药对应制备方法的萃取因子，以植物原料中农药残留量和最终制剂中农药残留量的比值方式由实验确定；B为该制剂的每日摄入量，kg，A和M的含义同上。若该批产品预处理的全部历史（所用农药的性质、数量、种植过过程中和采收后每次预处理的日期）一致，并且可根据良好种植和采集生产质量管理规范（GACP）进行精确复查，那么该检测的全部或部分免除是可以被允许的。 表4 物质限度（mg/kg）Acephate乙酰甲胺磷0.1Alachlor甲草胺0.05Aldrinanddieldrin(sumof)艾氏剂和狄氏剂(总计)0.05Azinphos-ethyl谷硫磷0.1Azinphos-methyl谷速松1Bromide,inorganic(calculatedasbromideion)无机溴(以溴离子计)125Bromophos-ethyl溴硫磷0.05Bromophos-methyl甲基溴磷松0.05Bromopropylate溴螨酯3Chlordane(sumofcis-,trans-andoxychlordane)氯丹(以其顺式、反式和氧化氯丹的总和计)0.05Chlrofenvinphos毒虫畏0.5Chlorpyriphos-ethyl氯蜱硫磷0.2Chlorpyriphos-methyl甲基陶斯松0.1Chlorthal-dimethyl氯酞酸甲酯0.01Cyfluthrin氟氯氰菊酯（总计）0.1λ-Cyhalothrinλ-格林奈1Cypermethrinandisomers(sumof)氯氰菊酯及其同分异构体（总和）1DDT(sumofo,p’-DDE,p,p’-DDE,o,p’-DDT,p,p’-DDT,o,p’-TDE,p,p’TDE)DDT(以o,p’-DDE,p,p’-DDE,o,p’-DDT,p,p’-DDT,o,p’-TDE,p,p’TDE的总和计)1Deltamethrin溴氰菊酯0.5Diazinon二嗪农0.5Dichlofluanid抑菌灵0.1Dichlorvos敌敌畏1Dicofol三氯杀螨醇0.5Dimethoateandomethoate(sumof)乐果和氧(化)乐果（总计）0.1Dithiocarbamates(expressedadCS2)二硫代氨基甲酸盐类（以CS2形式）2Endosulfan(sumofisomersandendosulfansulphate)硫丹（以其同分异构体及其硫酸盐的总和计）3Endrin异狄氏剂0.05Ethion乙硫磷2Etrimphos乙嘧硫磷0.05Fenchlorophos(sumoffenchlorophosandfenchlorophos-oxon)(以皮蝇磷及其氧化物的总和计)0.1Fennitrothion杀螟松0.5Fenpropathrin甲氰菊酯0.03Fensulfothion(sumoffensulfothion,fensulfothion-oxon,fensulfothion-oxonsulfon,andfensulfothionsulfon)丰索磷（以丰索磷、丰索磷-oxon、丰索磷-oxonsulfon及丰索磷-sulfon的总和计）0.05Fenthion(sumoffenthion,fenthion-oxon,fenthion-oxonsulfone,fenthion-oxonsulfoxid,fenthionsulfoneandfenthion-sulfoxide)倍硫磷(以倍硫磷，倍硫磷-oxon，倍硫磷-oxonsulfone，倍硫磷-oxonsulfoxide，倍硫磷砜和倍硫磷-sulfoxide总和计)0.05Fenvalerate氰戊菊酯1.5Flucythrinate氟氰戊菊酯0.05τ-Fluvalinateτ-氟胺氰菊酯0.05Fonophos地虫磷0.05He