胚脑宫内缺血缺氧时GSK-3β 和β-Catenin mRNA 的

1、胚脑宫内缺血缺氧时GSK-3 和-Catenin mRNA 的摘 要：目的 探讨不同发育期胚鼠宫内缺血缺氧脑损伤中Wnt 信号通路关键分子GSK-3和 -Catenin mRNA 水平的变化。方法 分别将孕14d、16d、18d、20d 的SD 大鼠随机分为实验组和对照组。实验组钳夹双侧子宫动脉30min 建立宫内缺血缺氧模型，再灌注24h 后留取胚脑标本。对照组不钳夹子宫动脉，与实验组的对应时间点留取标本。采用HE 染色和Tunel 标记法检测各组神经元的凋亡情况。Real Time PCR 检测Wnt 信号通路关键分子GSK-3 和-catenin mRNA 的表达变化。 结果 实验组神经

2、细胞嗜碱性增强，核固缩浓染。E14,E16,E18,E20 不同发育时期缺血再灌注后凋亡细胞数较相应对照组显著增高（p0.05）。实验组各不同发育时期凋亡细胞数两两比较差异无统计学意义（p0.05）。Real Time PCR显示-Catenin 及GSK-3 mRNA 表达在实验组与对照组之间无明显差异（p0.05）。实验组各不同发育时期两两比较差异亦无统计学意义（p0.05）。结论 Wnt 通路和发育期宫内缺血缺氧性脑损伤的关系有待进一步研究。关键词：缺氧缺血性脑损伤；Wnt 通路；凋亡中图分类号：R742.81 引言宫内慢性缺血缺氧可损伤胎儿脑细胞，累及神经系统发育中的多个区域而遗留永久

3、性的损伤，而未成熟儿对缺氧的耐受性也远较成熟儿1。Wnt 通路是调控脑发育的关键通路，对中枢神经系统轴线形成、海马发育、神经干细胞的增殖分化等均起着重要作用2，3。现有研究证实，Wnt 经典途径参与了心肌细胞缺血缺氧损伤。急性心肌梗塞时，GSK-3 表达上调，使用GSK-3 抑制剂可使-catenin 在胞浆和胞核中积聚激活Wnt/-catenin/LEF-TCF通路而使梗死面积减小，提示Wnt 通路的活化对心肌细胞有保护作用4,干预Wnt 通路的表达有可能成为今后干预缺血缺氧损伤的新途径。我们采用短暂钳夹双侧子宫动脉的方法建立宫内缺血缺氧脑损伤模型（HIBD），HE 染色结合Tunel 法检

4、测凋亡细胞鉴定HIBD 模型,并使用Real Time PCR 检测Wnt 经典途径中关键分子GSK-3 和-catenin mRNA 的表达，以探讨Wnt 通路与缺血缺氧脑损伤的关系。2 材料与方法2.1 实验动物及分组SD 大鼠（购自四川大学实验动物中心），雌性30 只,体重195250g,雄性20 只,体重210300g,在室温25、相对湿度40%70%的屏障系统内饲养。按雌雄 1:1 的比例每晚20:00 合笼,次晨8:00 取阴道分泌物镜检,发现精子为妊娠第0 日。采用完全随机设计将孕鼠分为实验组及对照组，每组各20 只。实验组分别于怀孕14 天，怀孕16 天，怀孕18 天，怀孕20

5、 天行子宫动脉钳夹术（对照组行假手术），记为 E14，E16，E18，E20。缺血再灌注24h 后取胚脑标本。对照组与实验组对应的相同时间点取标本。1 本课题得到国家自然科学基金面上项目（No. 30400478）资助。- 2 -2.2 宫内缺血缺氧模型的制备手术时保持手术室温度在26左右。10 gL 的戊巴比妥钠做腹腔麻醉(00033 mLg)，常规备皮消毒铺巾，开腹，暴露双侧子宫，用4 个微小动脉夹分别夹住双侧子宫血管30min，钳夹过程中不断更换覆盖于子宫上的温生理盐水纱布，保持局部温度在37左右。30min 后恢复血供，关腹。2.3 Real Time PCR 检测各组分别于再灌注24

6、h 后腹腔麻醉剖宫，取出胚鼠，分离胚脑。脑组织总RNA 的提取：用TRIzol（美国Invitrogen 公司）提取上述各样本总RNA。逆转录mRNA 为cDNA：采用Revert AidFrist Strand cDNA Synthesis Kit（立陶宛MBI 公司）制备cDNA，反应体系20l。GSK 和-catenin 引物、探针：由上海生物工程有限公司合成标记。序列如下：GSK上游引物为5- CACAGAACCTCTTGCTGGAT-3 ； 下游引物为 5-GGTGCCCTGTAGTACCGAGA-3；TaqMan 探针为5CTCCTCGGACCAGCTGCTTTGC3。-caten

7、in 上游引物为 5- GGAAAGCAAGCTCATCATTCT-3 ； 下游引物为 5-AGTGCCTGCATCCCACCA -3；TaqMan 探针为5CAGCACTCTGCTTGTGGTCCACA3。阳性内对照基因：GAPDH 引物、探针由上海生物工程有限公司合成标记。其上游引物为5-CCTCAAGATTGTCAGCAAT-3 ；下游引物为 5-CCATCCACAGTCTTCTGAGT-3 ；TaqMan 探针：5- ACCACAGTCCATGCCATCAC-3。Real Time PCR 反应：取上述样本cDNA 各2l，进行Real Time PCR 反应（反应体系30l），采用T

8、aqMan Universal PCR MasterMix，No Amp Erase UNG （美国ABI 公司），ABI PRISM 7300 Sequence Detector （美国ABI 公司）。反应条件：94热启动2min，9420s，5320s，6030sec，45cycles。采用实时定量RT-PCR 相对定量分析法： 2Ct 法进行计算。以GAPDH 作标准校正，计算产物相对量。2.4 HE 染色和Tunel 标记法各组于再灌注24h 腹腔麻醉后剖宫，取出胚鼠，分离胚脑。常规方法石蜡包埋，制成4的石蜡切片。对各实验组和对照组的HE 染色切片进行细胞形态的观察和比较。用TUNEL

9、法（Roche 公司）荧光标记凋亡DNA 片段,具体操作程序按说明书进行。荧光显微镜下阳性细胞或凋亡细胞呈黄绿色,细胞核呈斑点状或斑块状。用计算机图象分析系统软件（Imagepro plus 4.01）在高倍镜下(400)计数阳性凋亡细胞表达数，选择实验组与对照组胚鼠不同发育期相对应的切片(每张切片计数6 个视野)。2.5 统计学方法计量数据用x s 表示。采用随机区组方差分析比较各实验组和对照组，各不同发育时期之间用SNK 法进行两两比较，P0.05 为差异具有统计学意义。3 结果3.1 GSK-3 和-catenin 的Real Time PCR 结果实验组缺血再灌注24h GSK-3 和

10、-catenin mRNA 表达与对照组相比差异无统计学意义。实验组各不同发育时期两两比较差异亦无统计学意义。见表1、2。- 3 -表1 不同发育期GSK-3 mRNA 相对表达量与对照组比较（p0.05）分组 n E14 E16 E18 E20对照组 26.94129.2 8.630.365 36.3731.653 16.87612.223实验组 8.0285.234 25.63540.278 18.68314.112 49.99810.654表2 不同发育期-catenin mRNA 相对表达量与对照组比较（p0.05）分组 n E14 E16 E18 E20对照组 0.08660.030

11、6 0.07520.0403 0.06750.0399 0.03630.0149实验组 0.06110.0265 0.08340.0654 0.03780.0234 0.09180.06993.2 TUNEL 荧光标记结果与对照组各不同发育期相比，E14,E16,E18,E20 实验组缺血再灌注后24h 凋亡细胞数均明显增高，其差异有统计学意义（p0.05）。实验组各不同发育时期凋亡细胞数两两比较差异无统计学意义（p0.05）。见图18。图1 E14 实验组缺血30min 再灌注24h 时 图2 E14 对照组(假手术后24h) TUNELTUNEL 染色结果.SP400 染色结果.SP400

12、图3 E16 实验组缺血30min 再灌注24h 时 图4 E16 对照组(假手术后24h) TUNELTUNEL 染色结果.SP400 染色结果.SP400图5 E18 实验组缺血30min 再灌注24h 时 图6 E18 对照组(假手术后24h) TUNELTUNEL 染色结果.SP400 染色结果.SP400- 4 -图7 E20 实验组缺血30min 再灌注24h 时 图8 E20 对照组(假手术后24h) TUNELTUNEL 染色结果.SP400 染色结果.SP4003.3 HE 染色结果实验组神经细胞嗜碱性增强，核固缩浓染，提示神经元受损(图9、图10)。图9 实验组缺血30mi

13、n 再灌注24h。 图10 对照组假手术后24h。HE 染色400 HE 染色4004 结论4.1 短暂钳夹子宫动脉的方法建立宫内缺血缺氧脑损伤模型HE 染色及TUNEL 荧光标记的结果证实，短暂钳夹双侧子宫动脉30min 再灌注24h 成功建立了宫内缺血缺氧脑损伤模型。本实验发现，钳夹子宫动脉30min 再灌注72h 可使神经元严重受损，表现为嗜碱性增强，核固缩浓染。TUNEL 即脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法，是对完整的单个凋亡细胞核或凋亡小体进行原位染色，能准确地反应细胞凋亡典型的生物化学和形态特征。本实验显示，钳夹子宫动脉的实验组在缺血再灌注24h凋亡阳性细胞显著高于对照

14、组，说明缺血再灌注可诱发神经元发生凋亡。与Rice 等建立的新生大鼠缺氧缺血模型相比，本实验中的动物模型能较好的展现宫内缺血缺氧损伤的更为复杂的病理生理机制，对研究妊娠中晚期慢性胎儿宫内窘迫的发病机制及防治具有更重要的意义。4.2 宫内缺血缺氧损伤对Wnt 信号经典通路的影响Wnt 通路是细胞增殖分化的关键调控环节5，在胚胎发育和肿瘤发生中起着重要作用。对神经系统而言，此通路参与了对神经前体细胞增殖、分化以及细胞命运决定的调控，并在皮层模式建立，神经元迁移，轴突定向，树突形态发生等方面发挥重要作用，其表达异常与精神分裂症，阿尔采默综合征，孤独症，发育期脑肿瘤等多种疾病有关6，7，8，9。Wnt

15、信号的激活主要分为经典途径，Wnt/Ca2+-cGMP 途径和Wnt/polarity 途径 10。Wnt 信号- 5 -首先激活细胞表面佛力子 (FZ)受体，活化的FZ 通过Dvl 抑制GSK-3，继而拮抗-catenin摧毁器的作用，使胞浆中-catenin 积聚并进入核内，启动转录因子LEF/TCF，激活下游靶基因11。本实验选择Wnt 经典途径中的关键分子GSK-3 和-catenin mRNA 水平的变化探讨Wnt 通路在缺氧缺血性脑损伤中的表达变化。本实验表明，缺血再灌注后GSK-3 和-catenin mRNA 水平较对照组无显著性差异。前期实验结果发现，宫内缺血缺氧再灌注24h

16、 后GSK-3 蛋白表达显著增高，-catenin 蛋白表达变化无差异。这提示缺血再灌注时Wnt 通路可能受到了一定程度的抑制，但调控点可能发生在转录后的翻译阶段。对其具体的作用环节及可能机制尚有待于进一步的研究证实。参考文献1 Hppi PS. Advances in postnatal neuroimaging: relevance to pathogenesis and treatment of brain injury. ClinPerinataol, 2002; 29(4):827-856.2 Machon O, van den Bout CJ, Backman M, et al.

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20、ed J, 2002;78(917):142-148.8 Caricasole A, Copani A, Caraci F, et al. Induction of Dickkopf-1, a negative modulator of the Wnt pathway, isassociated with neuronal degeneration in Alzheimers brain. Neuroscience, 2004;24(26):6021-6027.9 Howng SL, Wu CH, Cheng TS, et al. Differential expression of Wnt

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22、row/LRP5,6 and axinindependently of Zw3/GSK3 activity. Dev Cell, 2003;4(3):407-418.Changes of GSK-3 and -Catenin mRNA in Brain of RatEmbryo Suffering from IntrauterineHypoxia-ischemiaBrain DamageTang Yiwei, Mao Meng ,Tang jianjun, Zhou HuiDepartment of Pediatrics, West China Second Hospital, Sichuan

23、 Uninversit, Chengdu (610041)AbstractWnt-signalling pathway has pivotal roles during the development of embryo brian. Recent studies haveimplicated a role for the canonical WNT/-catenin signal transduction in rat hypoxic-ischemiapreconditioned myocardium. However, the relationship between Wnt pathway and intrauterinehypoxia-ischemia brain damage (HIBD) has not been described. We used a transient intrauterine modelas embryo HIBD in gestational rat (14, 16, 18, 20days). The rats were randomly divided into twogroups. For transient intrauterine ischemia group, the gestational rats bilateral ute