细胞内游离Ca2＋和cAMP浓度在胃癌细胞凋亡过程中的变化特点

1、    细胞内游离Ca2和cAMP浓度在胃 癌细胞凋亡过程中的变化特点        摘要目的：探讨胃癌细胞凋亡过程中细胞内游离Ca2（Ca2i）浓度和环磷酸腺苷（cAMP）浓度的变化特点及意义。方法：选择顺铂诱导胃癌细胞凋亡，采用光镜、电镜、琼脂糖凝胶电泳和流式细胞仪检测凋亡；Fura2荧光负荷技术测Ca2i，竞争性蛋白结合法测cAMP浓度。结果：顺铂浓度为2g/ml作用于胃癌细胞24小时出现典型的凋亡改变，即凋亡小体、细胞皱缩，染色质固缩和片段化，DNA梯状条带

2、，流式细胞仪上见“凋亡峰”；胃癌细胞凋亡过程中Ca2i明显升高，以凋亡早期更为明显，cAMP浓度也高于对照组。结论：Ca2i和cAMP浓度在胃癌细胞凋亡过程中表现为上调趋势。关键词胃癌细胞凋亡Ca2cAMP Change of Intracellularfree Calcium and cAMP levels in the Process of Gastric Cancer Cellular Apoptosis Xing Chengzhong Chen Junqing Department of Oncology, First Clinical College of China Medical

3、 University， Shenyang Abstract To study the change of intracellularfree calcium(Ca2i) and cAMP levels in the process of gastric carcinoma cellular apoptosis. Apoptosis induced by cisplatin in gastric cancer cell was investigated by applying light microscopy, electron microscopy, agarose gel electrop

4、horesis and flow cytometry. Ca2i were determined by applying Fura2 fluorescein load technic. cAMP levels were determined by applying competitive protein binding method. Gastric carcinoma cell treated with cisplatin (2ug/ml)for 24 hours expressed typical change of apoptosis, such as apoptosis body, c

5、ell shrinkage, condensation and fragmentation of chromosomes, DNA ladder bands, apoptosis peak in flow cytometry. Ca2i in the process of gastric carcinoma cellular apoptosis was significantly higher than that in the control,especially at the beginning stage of apoptosis. cAMP level was higher than t

6、hat in control. In conclusion, Ca2i and cAMP levels were significantly higher than those in the control in the process of gastric carcinoma cellular apoptosis. Key Words Gastric carcinoma Apoptosis Ca2 cAMP 近年研究表明，肿瘤不仅是增殖和分化异常的疾病，同时也是凋亡异常的疾病1，胃癌的发生、发展和浸润转移也与凋亡密切相关2,3。Ca2和cAMP是各种生命现象信号传导中的重要信号分子，但在胃癌

7、细胞凋亡中的意义，尚未见报道。本研究采用顺铂诱导人胃癌细胞系BGC823凋亡，并检测细胞凋亡各阶段细胞内游离Ca2浓度（Ca2i）和cAMP浓度的变化，以探明Ca2和cAMP在胃癌细胞凋亡中的变化特点。1材料与方法1.1主要试剂和仪器RPMI1640美国LIFETECH公司产品；胰蛋白酶（Trypsin）美国Difco公司产品；顺铂为山东齐鲁制药厂产品；钙荧光指示剂Fura2/AM为美国Sigma公司；125IcAMP试剂盒为上海中医药大学产品。透射电镜Hitachi600和扫描电镜Hitachi450均为日本日立公司产品；流式细胞仪FACScan美国BectonDickinson公司；电泳仪

8、DGENE美国BioRad公司；F2000荧光分光光度计日本HITACHI公司；液体闪烁计数仪LS6500为美国Beckman公司。1.2方法1.2.1细胞培养人胃癌细胞系BGC823（由北京医科大学引进）复苏后培养于含10小牛血清的RPMI1640营养液中，23天传代一次。取对数生长期细胞，加顺铂至终浓度为2g/ml，选择不同时间点用光镜、常规透射电镜和扫描电镜制片观察凋亡的形态学变化。收集各时间点细胞（106个），提取DNA，用含溴化乙锭的1.5的琼脂糖电泳观察DNA条带，照像；收集时间点细胞（106个），制成细胞悬液，用流式细胞仪进行细胞周期分析，激光激发波长为488nm。1.2.2Ca

9、2i测定胃癌细胞系BGC823加顺铂后不同时间收集细胞，用0.25台盼蓝染色，计数活细胞为95以上，细胞悬液37预温5分钟，加入终浓度5mol/LFura2/AM，37，恒温振荡45分钟，持续通95O2、5CO2混合气，以一定量HPSS终止反应，1000转/分离心5分钟，弃上清，再次洗一次（同上），最后细胞悬液于HPSS中调整细胞数为2×106个/ml，每次测Ca2浓度前再以HPSS离心洗一次（同上），以分光光度计检测，发射光波长为510nm，激发光波长为340及380nm，两波长下最大荧光由加入终浓度为0.2Triton测得，最小荧光由加入终浓度为8mmol/L(pH>8.5

10、)的EGTA获得，每次测Ca2前输入在上述两激发波下测得的细胞悬液自发荧光值及解离常数（224nmol/L），输入电脑软件运算可得出Ca2i值。1.2.3cAMP检测方法生长状态较好的细胞接种于24孔板培养，分对照组（未加药组）、加顺铂诱导凋亡组（加药后30秒至24小时），稀释成2×104个细胞/ml，最终反应体积为1ml，沸水中煮沸3分钟终止反应，取50l（含103个细胞）缓冲液置于20冻存待测cAMP。据125IcAMP放免试剂盒说明作标准曲线并测每一样品的cAMP浓度（pmol/103cell）。1.3统计学处理用t检验2结果2.1顺铂诱导胃癌细胞系BGC823凋亡及其检测加顺

11、铂到终浓度为2g/ml诱导凋亡，加药后24小时出现典型的凋亡改变，即相差显微镜：用顺铂处理24小时后见细胞核浓缩，细胞变圆，可见膜突起起泡，细胞完整，见凋亡小体；透射电镜：收集顺铂处理24小时细胞，电镜观察见典型凋亡所见，核染色质积聚边集，新月形或帽状，细胞器结构清晰，胞浆浓缩或裂解成质膜包绕的碎片；扫描电镜：细胞变圆，胞膜突起起泡，胞核浓缩；琼脂糖凝胶电泳：顺铂处理24小时，在电泳带上呈现有一定间隔的梯状条带，对照组无此特征；流式细胞仪：顺铂处理24小时，见G1峰左侧出现亚二倍体细胞群的峰型。2.2细胞内游离Ca2浓度测定结果未加顺铂处理的对照组Ca2i波动于124.31130.24nmol

12、/L，平均浓度为126.67±3.06nmol/L。加顺铂至终浓度2g/ml，诱导凋亡，检测处理1/120(30秒)、2和24小时Ca2i，结果表明，细胞凋亡各阶段Ca2i明显升高（P<0.01），而以处理30秒时最高（表1）。表1顺铂诱导凋亡过程Ca2i浓度(±s)nmol/L加药时间(h)Ca2itP值1/120(30s)244.00±9.8519.72<0.012181.33±3.5120.32<0.0124187.67±4.5119.36<0.01对照组126.67±3.06t值为加药组与对照组比较的2

13、.3胃癌细胞凋亡各阶段cAMP浓度测定结果用顺铂诱导胃癌细胞凋亡，对照组cAMP值为0.0213±0.0041pmol/103cell，加药后30scAMP浓度0.0235±0.0034pmol/103cell呈上升趋势，但差异不显著（P>0.05），加药后212小时cAMP浓度为0.0278±0.00290.0345±0.0038pmol/103cell，高于对照组，差异显著（P<0.05）（表2）。表2顺铂诱导凋亡时cAMP浓度(±s)nmol/L加药时间cAMP浓度tP值(h)(pmol/103cell)1/120(30s)0

14、.0235±0.00340.72>0.0520.0278±0.00292.33>0.0560.0371±0.00193.19<0.05120.0345±0.00384.43<0.05240.0299±0.00273.20<0.05对照0.0213±0.0041t值是与对照组比较的值3讨论胞浆内信号传导过程主要包括三个信使系统4：腺苷酸环化酶系统、肌醇脂质系统和钙钙调蛋白系统，三个信使系统中的主要信号分子包括cAMP、IP3、PKC、Ca2等，而Ca2在信号传导中起重要作用，是各条信号传导通路的枢纽5。正常

15、状态下Ca2主要存在于细胞外，细胞内游离Ca2含量很低，然而正是这些含量甚微的Ca2却发挥着重要作用4。因此，本研究首先选择细胞内游离Ca2作为研究胃癌细胞凋亡信号传导机制的突破点，应用Fura2为结合Ca2的荧光指示剂测定胃癌细胞凋亡各阶段Ca2i的动态变化，对此国内外尚未见报道。研究结果表明，对照组细胞内游离Ca2浓度为126.67±3.06nmol/L，加顺铂诱导凋亡早期（30秒）细胞内游离Ca2浓度迅速升高为244.00±9.85nmol/L，明显高于对照组（P<0.01），加药后2小时和24小时Ca2i为181.33±3.51和187.67

16、7;4.51nmol/L，虽较30秒时Ca2i降低，但仍明显高于对照组（P<0.01）。既往用Vp16诱导乳癌细胞凋亡以及用肿瘤坏死因子诱导乳癌细胞凋亡时，也发现Ca2i升高，激活Ca2依赖核酸内切酶引起DNA片段化和细胞凋亡6,7。本研究证明胃癌细胞凋亡时Ca2i也升高，与其它肿瘤细胞凋亡时Ca2i变化一致，说明Ca2在胃癌细胞凋亡过程中也起重要作用。同时，本研究还发现胃癌细胞凋亡早期（30秒），Ca2i升高尤为明显，可推测Ca2i升高在胃癌细胞凋亡启动时具有重要作用。细胞内cAMP含量甚微，在不受刺激的情况下为0.1nmol/mg以下，cAMP作为第二信使参与细胞的增殖、分裂、脂肪分

17、解等多种生命活动4,8。本研究用顺铂诱导胃癌细胞凋亡，动态检测凋亡各阶段cAMP的变化，结果表明，随着凋亡的发生，cAMP呈上升趋势，特别是反应6小时以后差异显著，说明cAMP参与细胞凋亡的信号传导，且呈上调趋势。有研究表明，肿瘤细胞增殖时cAMP呈下降趋势，而用化疗药抑制其生长时，cAMP含量升高9。David研究cAMP在细胞凋亡时的变化发现，用糖皮质激素诱导胸腺细胞凋亡，cAMP含量升高10。在胃癌细胞凋亡时亦发现cAMP升高，因此，通过提高胞浆cAMP来诱导肿瘤细胞凋亡和抑制其增生，已成为胃癌治疗研究的新线索。本文课题受辽宁省自然科学基金资助(编号972276)作者单位：中国医科大学第

18、一临床学院肿瘤科（沈阳市110001）参考文献1 Marx J.Cell death studies yield cancer dues.Science,1993;259:760 1 2 Saegusa M,Takano Y,Wakabayashi T,et al.Apoptosis in gastric carcinoma and its association with cell proliferation and differentiation. Jpn J Cancer Res,1995;86:743 8 3 Yuh Fang Chang,Li Lydia Li,Chew Wun Wu

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