聚乙二醇修饰鼠抗人CD3单克隆抗体

1、聚乙二醇修饰鼠抗人CD3单克隆抗体         11-01-30 11:16:00     编辑：studa20                  作者：马杭圣, 王 鸿, 孙汉栋, 易喻, 应国清【摘要】  目的: 确定一条聚乙二醇化鼠抗人CD3单克隆抗体（mAb）和抗体片段的制备工艺路线。方

2、法: 以胃蛋白酶酶解并通过凝胶柱分离和纯化得到抗体Fab, 利用PEGSPA修饰抗体和抗体片段Fab上的氨基, 通过体内和体外T细胞增殖实验, 考查修饰后的抗体和抗体片段的免疫活性。结果: 较佳的修饰工艺条件为: 在pH9.0硼酸缓冲液, 反应温度25, 抗体浓度0.2 g/L, 抗体和聚乙二醇摩尔比为120, 反应3 h。修饰后抗CD3 mAb全抗, 对T淋巴细胞增殖抑制活性下降了32.3%, 抗体Fab下降了8.0%, PEG化Fab下降了19.9%。利用ELISA检测血液中修饰后的抗体和抗体片段的半衰期。结果显示mPEG修饰后抗体和抗体片段血药浓度降低明显减缓, 修饰后抗CD3抗体半衰期

3、从2.66 h延长到8.72 h, 延长了3.28倍。而修饰后抗体Fab片段半衰期从2.21 h延长到4.17 h, 延长了1.90倍。结论: 利用聚乙二醇修饰抗体和抗体片段, 提高了抗体半衰期, 且无细胞毒性, 活性损失较小, 该技术具有较高的可行性, 可极大地提高mAb尤其是非人源性抗体在临床上的应用。 【关键词】  单克隆抗体; CD3; 聚乙二醇; 化学修饰; 免疫活性    鼠抗人抗CD3 单克隆抗体（mAb）因具有毒副作用少、 使用剂量低、 半衰期长等优点, 而在器官移植领域中得到了广泛的应用。但鼠抗人抗CD3 mAb也存在很多缺点, 最主要

4、的是该抗体是鼠源性, 器官移植患者单独使用该抗体治疗后57 d , 机体产生严重的特异性体液免疫反应, 导致其被快速清除, 半衰期明显缩短, 限制了其治疗效果。目前国内外普遍采用聚乙二醇(PEG)化学修饰1来起到药物毒副作用减少、 半衰期延长、 免疫源性降低的目的2, 3, 并且修饰后的药物也被各国药监部门认可, 并批准上市。我们利用胃蛋白酶酶解抗体制备抗体Fab, 并对PEG修饰鼠抗人抗CD3 mAb和Fab片段的反应条件进行优化, 探讨了各因素对修饰度大小影响, 再对获得的PEG化抗体及Fab片段的体内体外生物活性功能进行了初步研究。    1  材

5、料和方法    1.1  材料  清洁级ICR雄性小鼠20 g购于浙江省医药科技学院, 鼠抗人CD3 mAb购于北京天广实生物技术有限公司, 牛血清白蛋白(BSA), Sephadex G75, sephadex G25, TNBS, 碘乙酰胺等购于Sigma公司, PEG5000SPA购于北京凯正生物技术有限公司, 巯基乙醇购于博大泰克公司, 辣根过氧化酶标记的羊抗小鼠IgG抗体购自北京博奥森生物技术有限公司, 无血清RPMI1640培养液、 噻唑兰(MTT)、 伴刀豆球蛋白A(ConA)和脂多糖(LPS)购自上海生工生物工程技术服务有限公司

6、。    1.2  方法    1.2.1  抗CD3mAb的纯化  取鼠抗人CD3mAb, 置于截留相对分子质量（Mr）为100 000的Amicom 30超滤膜离心管(美国Amicom 公司产品)超滤分离, 4 500 r/min, 15 min离心浓缩除去牛血清白蛋白, 加入0.1 mol/L  pH7.4  PBS稀释, 计算IgG回收率。    1.2.2  抗CD3mAb F(ab)2 及Fab片段的制备和纯化  利用胃蛋白

7、酶分解IgG, 将抗体断链为Fab和Fc片段4。即取结晶胃蛋白酶3 mg, 溶于0.1 mol/L pH4.0醋酸缓冲液500 mL中, 取抗CD3 mAb (1 g/L)100 L, 加入1 mL上述溶液中。于30作用16 h。置于截留Mr为50 000的Amicom 30超滤膜离心管(美国Amicom 公司产品), 4 500 r/min, 15 min离心浓缩, 加入0.1 mol/L   pH7.4  PBS缓冲液过夜。以上清过Sephadex G75(40 cm×1.0 cm)以0.1 mol/L  PBS缓冲液洗脱, 得抗CD3 m

8、Ab F(ab)2片段。将上述收集液, 加入硫醇使成0.1 mol/L, 在室温下搅拌30 min。加入1 mol/L的碘乙酰胺（Indoacetamide）使成为0.1 mol/L, 室温下搅拌1 h。置于截留Mr为30 000的Amicom 30超滤膜离心管(美国Amicom 公司产品) ,  4 500 r/ min,  15 min离心浓缩, 加入0.1 mol/L  pH7.4  PBS过夜。以上清过SephadexG75(40 cm×1.0 cm)收集。得抗CD3 mAb Fab片段。分别测A280和A260值, 计算蛋白质质量浓度

9、(g/L)1.45（A280）-0.74（A260）, 并计算回收率。    1.2.3  PEG化抗CD3mAb和抗体片段的制备  取适量PEG5000SPA加入鼠抗人CD3 mAb和抗体片段5, 6, 在不同的条件下进行反应, 过排阻柱分离纯化。平均氨基修饰度测定采用TNBS法对修饰抗体进行平均氨基修饰度测定。氨基修饰率= 1-氨基残留率(%) 。表1  L9（34）试验因素水平    1.2.4  PEG化抗CD3mAb和抗体片段的体外免疫活性和细胞毒性检测  MTT法测定: 取

10、常规制备小鼠脾细胞悬液, 用无血清RPMI1640 培养液调整细胞密度为1×1010/L, 加于96 孔培养板每孔加板50 L, 前4排不加刺激源, 后8排分别加入ConA和LPS（刺激T细胞和B细胞的增殖）, 再将PEG化抗CD3 mAb和抗体片段以原浓度为0.2 g/L, 以不同浓度加入37、 50 mL/L  CO2培养44 h, 各孔加入MTT（2 g/L, PBS溶解）50  L/孔, 继续培养4 h。1 800 r/min离心5 min, 弃去各孔内液体, 加含2%4% 1 mol/L盐酸的DMSO溶液150  L/孔, 置暗处室温震荡153

11、0 min, 酶标仪492 nm处测A值。计算SI公式为: SI=（A刺激孔-A本底）/（A正常孔-A本底）。    1.2.5  PEG化抗CD3mAb和抗体片段的体内免疫活性的检测  迟发性超敏反应测定: 取65只清洁级ICR小鼠(1820 g), 分成13组, 用硫化钠腹部脱毛, 将新配制的DNFB丙酮麻油溶液50 L均匀涂抹腹部脱毛处致敏。致敏当天,  致立即腹腔注射(ip), 其中1组注射生理盐水, 另外12组每组分别注射不同药物3个剂量(高、 中、 低分别为0.2、  0.04、 0.008 g/L, 以0.1

12、mL/10 g体质量注射, 隔天注射。致敏第5天,  用新配制的DNFB丙酮麻油溶液10 L 均匀涂抹于小鼠右耳（两面）进行攻击。攻击后 24 h 颈椎脱臼处死小鼠, 剪下左右耳壳。用打孔器取下直径8 mm的耳片, 称质量。    1.2.6  PEG化抗CD3mAb和抗体片段的体内半衰期的检测  取家兔4只（12 kg）, 分别静脉注射(iv)不同的药物0.1 mg/kg, 2 mL, 分别于0、 0.5、 1、 2、 4、 8、 12、 24、 48 h取血1 mL, 将血样离心30 min 后分离血清,  -20保存待

13、测。ELISA法测定: 待测血清用PBS稀释成1125, 1250, 1500, 11 000, 12 000, 14 000加到96孔培养板, 每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1 mL。用0.05 mol/L  pH9.6碳酸盐包被缓冲液将待测血清进行包被。4过夜(同时做空白孔, 阴性对照孔及阳性对照孔)。次日, 弃去孔内溶液, 用PBSTween20 (PBST)缓冲液洗涤3次, 每次3 min。加10 g/L BSA  0.1 mL于上述已包被反应孔中, 置37孵育1 h。然后洗涤。于各反应孔中, 加入新鲜稀释的酶标抗体(经滴定后的稀释度为15 000) 0.1 mL。

14、37孵育0.51 h, 洗涤。于各反应孔中加入临时配制的OPD底物溶液0.1 mL, 37避光反应1030 min,  加入2 mol/L硫酸0.05 mL终止反应,  在酶标仪上测定495 nm吸光值。血药浓度进行药物动力学分析。    2  结果    2.1  抗CD3mAb的纯化  利用考马氏亮蓝法, 测定超滤膜分离前后的蛋白质浓度,  IgG回收率为84.03%。    2.2  抗CD3mAb Fab片段的制备和纯化  经葡聚糖G75凝胶柱排阻分离后, 有明显的二个峰, 第1个峰为双硫键未被打断的抗CD3mAb F(ab)2,  第2个峰为本实验所要获得的Fab片段峰（图1）。收集第1016管过滤液, 超滤浓缩, 利用吸收差公式得到: 抗体片段Fab蛋白质质量浓度（g /L）1.45×0.582-0.74×0.2660.647 g/L。抗体片段Fab回收率=0.647/1.0×100%=64.7%。未被酶解的抗CD3 mAb（1列）Mr在200 000以上,  155 000附近出现了蛋白带（200 000以上的条带应该是抗体的多聚物