转化生长因子β1整合素连接激酶信号通路在大鼠肾小管上皮细胞转分化中的作用及大黄素对其的干预效应

1、    【摘要】    目的：研究转化生长因子1/整合素连接激酶（transforming growth factorbeta1/integrinlinked kinase, TGF1/ILK）信号通路在白细胞介素1（interleukin1, IL1）诱导的大鼠肾小管上皮细胞肌成纤维细胞转分化（tubular epithelialmyofibroblast transdifferentiation, TEMT）中的作用，并探讨大黄素是否是通过抑制TGF1/ILK信号通路而影响TEMT。 方法：以体外培养的正常大鼠

2、肾小管上皮细胞株（NRK52E）为研究对象，分为空白对照组、大黄素对照组、IL1诱导组、大黄素阻断组、TGF1型受体阻断剂（SB431542）阻断组、大黄素和SB431542共同阻断组、大黄素预处理组和大黄素逆转组。NRK52E细胞在上述处理因素下培养48 h后，在倒置相差显微镜下观察细胞形态变化；免疫组化双标法检测细胞表型标志物平滑肌肌动蛋白（alphasmooth muscle actin, SMA）和E钙黏连素（Ecadherin）的表达；免疫组化单染法检测NRK52E细胞TGF1和ILK的表达，采用图像分析软件定量分析免疫组化染色结果；酶联免疫吸附测定法测定NRK52E细胞分泌的纤维连

3、接蛋白（fibronectin, FN）含量。结果：与空白对照组比较，IL1诱导TEMT的同时TGF1和ILK表达增加（P    【关键词】 白细胞介素1; 大黄素; 转化生长因子1; 整合素连接激酶; 大鼠 Chen TF, Chen M, Qin JH, Wang MY. J Chin Integr Med. 2009; 7(1): 5964. Received July 10, 2008; accepted September 29, 2008; published online January 15, 2009. Indexed/abstract

4、ed in and full text linkout at PubMed. Journal title in PubMed: Zhong Xi Yi Jie He Xue Bao. Free full text (HTML and PDF) is available at . Forward linking and reference linking via CrossRef. DOI: 10.3736/jcim20090109Open Access Interventional effects of emodin on transforming growth factorbeta1/int

5、egrinlinked kinase signal way in interleukin1induced transdifferentiation of rat tubular epithelialmyofibroblasts Tingfang CHEN1, Ming CHEN1, Jianhua QIN1, Mingyong WANG2 1. Department of Nephrology, Affiliated Hospital, Luzhou Medical College, Luzhou, Sichuan Province 646000, China 2. Laboratory of

6、 Infection and Immunity, Affiliated Hospital, Luzhou Medical College, Luzhou, Sichuan Province 646000, China Objective: To study the effects of transforming growth factorbeta1/integrinlinked kinase (TGF1/ILK) signal way in interleukin1 (IL1)induced rat tubular epithelialmyofibroblast transdifferenti

7、ation (TEMT), and to investigate whether emodin inhibits IL1induced TEMT through the TGF1/ILK signal waydependent mechanism. Methods: Normal rat kidney epithelial cell line (NRK52E) was used in this study. NRK52E cells were divided into blank control group, emodin control group, IL1induced group, em

8、odininhibited group, SB431542 (TGF1 type receptor blocker)inhibited group, emodin plus SB431542inhibited group, emodinpretreated group and emodinreversed group. After 48hour culture, morphological changes of the NRK52E cells were observed by an inverted phase contrast microscope. The expressions of

9、alphasmooth muscle actin (SMA) and Ecadherin were detected by twocolor immunohistochemical staining, while the expressions of TGF1 and ILK were detected by onecolor immunohistochemical staining. We also performed the imaging analysis to quantitatively analyze the result of the immunohistochemical st

10、aining. The secretion of fibronectin (FN) was analyzed by enzymelinked immunosorbent assay. Results: Compared with the blank control group, IL1 might induce TEMT, which was showed in increasing expression of SMA, increasing secreting of FN and decreasing expression of Ecadherin, and at the same time

11、 the expressions of TGF1 and ILK were enhanced (P Conclusion: IL1 induces TEMT partly depending on TGF1/ILK signal way, partly via which emodin inhibits the TEMT induced by IL1. Keywords: interleukin1; emodin; transforming growth factorbeta1; integrinlinked kinase; rats 肾间质纤维化是多种肾脏疾病进展至终末期的共同病理表现，研究

12、认为肾小管上皮细胞肌成纤维细胞转分化（tubular epithelialmyofibroblast transdifferentiation, TEMT）而成的肌成纤维细胞是生成细胞外基质的主要细胞。关于肾小管上皮细胞转分化的分子机制尚未完全阐明，最近研究表明转化生长因子1/整合素连接激酶（transforming growth factorbeta1/integrinlinked kinase, TGF1/ILK）参与肾间质纤维化的发生。大黄素可通过影响细胞表型转化，抑制促纤维化因子的合成与分泌，调节细胞外基质合成与降解等机制抗肾间质纤维化。本实验旨在阐明TGF1/ILK信号通路是否参与了

13、TEMT，及大黄素是否通过影响TGF1/ILK信号通路抑制TEMT，进而达到抗肾间质纤维化作用。 1 材料与方法 1.1 材料与试剂 正常大鼠肾小管上皮细胞株（NRK52E）来源于美国菌种细胞保藏数据库(American Type Culture Collection, ATCC)，由四川大学华西医院肾内科惠赠；大黄素，南京清泽医药科技开发有限公司提供；白细胞介素1（interleukin1, IL1），以色列Cytolab公司提供；小鼠抗大鼠平滑肌肌动蛋白（alphasmooth muscle actin, SMA）单克隆抗体，Boster生物公司提供；兔抗大鼠ILK多克隆抗体、兔抗大鼠E钙

14、黏连素（Ecadherin）多克隆抗体、兔抗大鼠TGF1多克隆抗体、TGF1型受体阻断剂SB431542，Santa Cruz公司提供；大鼠纤维连接蛋白（fibronectin, FN）酶联免疫吸附测定（enzymelinked immunosorbent assay, ELISA）试剂盒和双染HistostainTMDS试剂盒，北京中杉金桥生物技术公司提供。 1.2 实验分组和干预处理 NRK52E细胞常规培养于37 、5% CO2饱和湿度孵箱中，培养液均为含5%小牛血清的DMEM（Sigma公司）。细胞培养至80融合后传代，传35代后以1.0×107个/L接种于装有无菌玻片的6孔

15、板，每孔2 ml，培养12 h，换用无血清的DMEM培养液继续培养24 h，使其处于G0期。将NRK52E细胞分为8组。（1）空白对照组：仅加入培养液；（2）大黄素对照组：加入含大黄素的培养液，大黄素终浓度为25 mg/L（以下大黄素终浓度均为此浓度）；（3）IL1诱导组：加入含IL1的培养液，IL1终浓度为0.01 mg/L（以下IL1的终浓度均为此浓度）；（4）大黄素阻断组：加入含IL1和大黄素的培养液；（5）SB431542阻断组：加含SB431542的培养液，用终浓度为10 mmol/L SB431542的培养液（以下SB431542的终浓度均为此浓度）预孵1 h后，换为含SB4315

16、42和IL1的培养液；（6）大黄素和SB                 431542共同阻断组：加含SB431542的培养液预孵1 h后换为含SB431542、IL1和大黄素的培养液；（7）大黄素预处理组：加入含大黄素的培养液预孵24 h后再换为含IL1和大黄素的培养液；（8）大黄素逆转组：加入含IL1的培养液预孵24 h后再加入含大黄素的培养液。每组设6个复孔。 1.3 NRK52E细胞形态学观察 上述各组细胞培养48 h后，在倒置

17、相差显微镜下观察细胞形态变化。 1.4 免疫组化检测NRK52E细胞ILK、TGF1、SMA和E钙黏连素表达 各组细胞培养48 h后，取出预留的盖玻片，用4多聚甲醛固定。免疫组化双染标记法检测SMA和E钙黏连素的表达，按双染试剂盒说明书步骤操作。SMA用5溴4氯3吲哚磷酸/硝基苯硫氰酸（BCIP/NBT）染色，E钙黏连素用3氨基9乙基卡巴唑（AEC）显色。应用常规的二步法检测ILK（AEC显色）和TGF1的表达3,3二氨基联苯胺（DAB）显色。 1.5 ELISA法检测NRK52E细胞FN分泌 取上述各组细胞培养上清液，在包被反应板每孔加入标准品或待测标本100 l，空白对照孔中加入稀释液10

18、0 l，37 孵育2 h。弃去液体，加生物素抗FN抗体，孵育1 h。洗涤后加亲和素过氧化物酶复合物抗体工作液，孵育30 min，加显色液和终止液。在酶标仪上450 nm处测定光密度（optical density，OD）值。根据OD值在试剂盒提供的标准曲线上找出对应浓度。 1.6 定量分析NRK52E细胞免疫组化染色结果 采用ImagePro P1us (IPP) Version 4.5专业图像分析软件(美国Media Cybernetics)进行分析。每张盖玻片在高倍镜（×400）下随机选取上、中、下、左、右5个视野，摄像并存入计算机，然后用IPP进行分析（在“Intensity

19、Cal”中定义背景色，在“Count/Size”中将阳性目标从背景色中分离出来，用阳性细胞的积分OD值代表各种蛋白表达量的多少）。 1.7 统计学方法 计量资料用x±s表示，各实验组和对照组间的比较采用SPSS 10.0统计软件包进行单因素方差分析，各组间两两比较采用LSDt检验。各项指标之间作Spearman秩相关分析。 2 结 果 2.1 IL1、大黄素和SB431542对NRK52E细胞形态学的影响 空白对照组和大黄素对照组NRK52E细胞具有典型的立方形或球形的上皮细胞铺路石样形态学特征（图1A和图1B）。IL1诱导组NRK52E细胞发生明显的形态学改变，显示成纤维细胞样外观

20、，转分化的细胞明显肥大、拉长，丧失其铺路石样生长方式（图1C）。大黄素阻断组、SB431542阻断组、大黄素和SB431542共同阻断组以及大黄素预处理组的细胞与对照组细胞形态差别不大（图1D、E、F和G）。与IL1诱导组比较，大黄素逆转组细胞无明显形态改变（图1H）。 2.2 IL1、大黄素和SB431542对NRK52E细胞表型标志物SMA和E钙黏连素的影响 空白对照组和大黄素对照组NRK52E细胞胞浆和胞膜E钙黏连素（红色）表达呈阳性，未见SMA（暗紫色）表达，两组间比较，差异无统计学意义（P0.05）。和空白对照组比较，IL1诱导组和大黄素逆转组在胞浆SMA表达呈阳性（P 2.3 IL

21、1、大黄素和SB431542对NRK52E细胞表达TGF1的影响 TGF1通过DAB染色染成棕黄色。空白对照组和大黄素对照组NRK52E细胞胞浆TGF1微弱表达，两组间比较差异无统计学意义（P0.05）。与空白对照组比较，IL1诱导组、SB431542阻断组和大黄素逆转组胞浆TGF1表达增强（P 2.4 IL1、大黄素和SB431542对NRK52E细胞表达ILK的影响 ILK通过AEC染色染成猩红色。空白对照组和大黄素对照组NRK52E细胞在胞浆和胞膜微弱表达ILK，两组间比较差异无统计学意义（P0.05）。与空白对照组比较，IL1诱导组和大黄素逆转组ILK在胞浆和胞膜表达增强（P 2.5

22、IL1、大黄素和SB431542对NRK52E细胞分泌FN的影响 空白对照组和大黄素对照组以及大黄素预处理组NRK52E细胞分泌FN量比较差异无统计学意义（P0.05）。IL1诱导组和大黄素逆转组FN分泌较空白对照组增加（P 2.6 TGF1、ILK的表达和SMA、E钙黏连素表达及FN分泌的相关性分析 Spearman秩相关分析结果显示，TGF1表达与SMA、FN、ILK表达呈正相关，与E钙黏连素表达呈负相关。ILK表达与SMA、FN表达呈正相关，与E钙黏连素表达呈负相关。见表2。表1 大黄素、SB431542和IL1对NRK52E细胞FN分泌及SMA、Ecadherin、TGF1和ILK表达

23、的影响 表2 TGF1、ILK的表达和SMA、E钙黏连素表达及FN分泌的相关性分析 3 讨 论 TEMT指肾小管上皮细胞失去上皮细胞的特性而获得肌成纤维细胞的特性。TGF为研究较多，作用较明确的参与转分化的细胞因子之一5。我们的实验也表明TGF1参与了IL1诱导的TEMT6。由于TGF除了促纤维化效应外，还有抗增生和抗炎症的效应，长期完全阻断TGF系统必然产生严重不良后果，例如敲除TGF1基因的小鼠因完全阻断TGF1的活性而产生致死性炎症7。因此，调控TGF的下游信号介质，可望成为治疗肾脏纤维化的新靶点。 ILK是一种Ser/Thr蛋白激酶。ILK能够通过与整合素1亚单位的结合介导细胞与胞外基质的连接，以依赖于磷脂酰肌醇3激酶的方式激活，并通过磷酸化下游底物蛋白激酶B/Akt、糖原合酶激酶3等使胞外信号得以向下游传递，参与多种信号传导通路8。在肾间质纤维化过程中，ILK是诱导转分化的关键调节因子，可能参与TEMT的4个关键