逆转录病毒介导的反义bcl-2序列促进足叶乙甙诱导的白血病细胞凋亡

1、    逆转录病毒介导的反义bcl-2序列促进足叶乙甙诱导的白血病细胞凋亡        摘要目的：探讨逆转录病毒介导的反义bcl-2序列对细胞凋亡的诱导作用。方法：PA317细胞包装逆转录病毒，病毒转导Jurkat细胞后用RT-PCR及Western印迹法检测bcl-2 mRNA及蛋白表达水平；用流式细胞仪计数及DNA电泳检测细胞凋亡。结果：转染反义bcl-2序列可使内源性BCL-2蛋白表达下降，提高白血病细胞株对足叶乙甙(Vp16)的敏感性，促进细胞凋亡。结论：反义bcl

2、-2序列能促进Vp16诱导的白血病细胞凋亡，为bcl-2反义技术治疗白血病的临床应用提供了实验依据。关键词核苷酸，反义逆转录病毒细胞凋亡Jurkat细胞基因，bcl-2 Enhancement of Vp16 inducing apoptosis of leukemic cells by retrovirus-mediated bcl-2 anti-sense RNACao Guodong, Wang Shenwu, Chen Dexi, et al. Central Laboratory, People's Hospital, Beijing Medical University,

3、Beijing100044AbstractObjective：To explore the effects of retrovirus-mediated bcl-2 antisense RNA on apoptosis of leukemic cells. Methods: Retrovirus was packaged in vitro with PA317 cells and Jurkat cell was transducted with collected virus; The expressions of bcl-2 mRNA and protein were assayed by

4、RT-PCR and Western blotting, respectively. Apoptosis was assayed by flow cytometry and DNA “ladder”. Results:Expression of intrinsic bcl-2 was decreased, and the sensitivity of leukemic cells to Vp16 and the apoptosis of leukemic cells line Jurkat cells were enhanced by transfected bcl-2 antisense R

5、NA. Conclusion: Antisense bcl-2 enhances Vp16 inducing apoptosis of leukemic cells. The results provide a useful experimental basis for leukemia therapy.Key wordsNucleotide, antisenseRetrovirusApoptosisJurkat cellGene, bcl-2反义RNA是与mRNA互补的RNA，它能够与特定的mRNA结合而抑制其表达。目前反义RNA已广泛用于抑制一些有害基因的表达或失控基因的过度表达。bcl-

6、2是近年来发现的一种抗凋亡基因，能够抑制造血细胞因撤消生长因子治疗、热刺激、射线、化疗药物等多种因素引起的细胞凋亡1。我们主要研究逆转录病毒介导的反义bcl-2对足叶乙甙(Vp16)诱导的白血病细胞凋亡的影响，以期为转基因治疗白血病提供实验依据。材料和方法1脂质体Lipofectin、SA-AP购自Boehringer Mannhein公司；G418、BCIP、NBT、RPMI 1640、DMEM及蛋白酶K购自Gibco BRL; MTT、PMSF、DEPC、NP-40及RNase A购自Sigma；胎牛血清购自Hyclone公司；NIH3T3及PA317由本室保存，Jurkat细胞来自中国医

7、学科学院基础医学研究所；兔抗人BCL-2多克隆抗体及生物素羊抗兔免疫球蛋白购自美国Santa Curz公司。2逆转录病毒正、反义bcl-2表达载体的构建bcl-2由北京医科大学人民医院病理科王络全博士赠送，为人cDNA(1.9kb,650bp处为BamH切点)，插入逆转录病毒载体pLXSN的EcoR切点，用BamH酶切鉴定bcl-2插入正、反方向。3包装PA317细胞生长至70%融合时，加入脂质体-DNA复合物(pLXSN-antibcl-2和pLXSN-Neo)。37、 5% CO2条件下培养10小时，更换为含10%胎牛血清的DMEM继续培养24小时，13传代，同时加入G418至600mg/

8、L，34天换液一次直至克隆形成。取单克隆传代，长满瓶后收集病毒上清，NIH3T3测定滴度(滴度为1×105)。用上述二种病毒上清分别感染Jurkat细胞，用G418(600mg/L)筛选出抗性细胞，命名为Jurkat-antibcl-2和Jurkat-neo。4RT-PCR取Jurkat-antibcl-2和Jurkat-neo细胞1×106，根据文献2进行RT-PCR。5Western blot取Jurkat-antibcl-2和Jurkat-neo细胞各3×106，加1×裂解液50l，煮沸10分钟后进行蛋白质定量，取100g蛋白质进行10%SDS聚丙

9、烯酰胺凝胶电泳，电转移至硝酸纤维素膜上。3%脱脂奶粉封闭后与bcl-2多抗作用4轻摇过夜，依次再加生物素标记的二抗，SA-AP，最后BCIP、NBT联合显色。6DNA电泳Jurkat-antibcl-2和Jurkat-neo细胞各3瓶，每瓶2×106，每种细胞分别加入Vp16至终浓度10，20，40mg/L，37培养12小时。操作按文献3进行，1%琼脂糖凝胶电泳分析。7流式细胞仪计数检测凋亡细胞取Jurkat-antibcl-2和Jurkat-neo细胞各1×106，加入Vp16(10mg/L)继续培养12小时。1000×g离心后重悬浮于100l PBS中，迅速加

10、入-20的80%乙醇，4固定12小时。离心后重悬浮于100l PBS中，加入RNaseA至20g/ml，室温消化30分钟后加入碘化丙锭至10g/ml，流式细胞仪检测亚二倍体细胞数。结果1转导pLXSN-antibcl-2后Jurkat细胞的bcl-2表达的变化Jurkat-antibcl-2及Jurkat-neo的RT-PCR结果见1。其bcl-2/GAPDH比值分别为1.28和0.74，表明转导pLXSN-antibcl-2后bcl-2 RNA的转录水平提高至1.7倍(包括mRNA和反义RNA)。Western印迹结果见2，Jurkat-antibcl-2及Jurkat-neo的积分吸光度(

11、旧称光密度)值分别为308.94和647.22，说明转导反义bcl-2序列能够明显抑制Jurkat细胞的bcl-2蛋白的表达。    1：pUC19/Msp I;2:Jurkat-antibcl-2;3:Jurkat-neo1bcl-2 RNA表达的RT-PCR产物凝胶电泳结果    1：Jurkat-antibcl-2;2:Jurkat-bcl-2;3:Jurkat-neo；4：蛋白质分子量标准2Jurkat-antibcl-2细胞BCL-2蛋白表达的Western blot结果2转导pLXSN-antibcl-

12、2对Vp16诱导的细胞凋亡的影响DNA电泳显示，与对照组相比，转导pLXSN-antibcl-2后梯状DNA片段量明显增加，表明pLXSN-antibcl-2能促进Vp16诱导的细胞凋亡(3)；用Vp16处理Jurkat-neo和Jurkat-antibcl-2细胞12小时后，用流式细胞仪可检测到在G1期前出现亚二倍体峰，分别为8.8%和39%(4)，t检验差异显著(P<0.01)。    1： DNA/EcoRI+Hind+pUC19/MspI;2：Jurkat-antibcl-2细胞+Vp16(10mg/L)；3：Jurkat-antibcl-

13、2细胞+Vp16(20mg/L)；4：Jurkat-antibcl-2细胞+Vp16(40mg/L)；5：Jurkat-neo细胞+Vp16(10mg/L);6：Jurkat-neo细胞+Vp16(20mg/L);7：Jurkat-neo细胞+Vp16(40mg/L)3不同浓度Vp16作用于Jurkat-antibcl-2细胞诱导的DNA降解梯形条带    a：Jurkat-neo; b:Jurkat-antibcl-24流式细胞仪检测Vp16处理后的细胞周期讨论转导逆转录病毒载体介导的反义bcl-2序列后，Jurkat细胞bcl-2 RNA转录水平较对

14、照组提高至1.7倍，由于RT-PCR可同时测定bcl-2 mRNA和反义RNA，因此转录水平的增高是mRNA降低和反义RNA增高的混合结果4；蛋白表达降低67.7%，说明逆转录病毒重组体表达反义bcl-2序列，且反义bcl-2序列在Jurkat细胞内表现反义作用，与bcl-2 mRNA结合，抑制了BCL-2蛋白的表达。BCL-2蛋白表达降低对Jurkat细胞产生了较大的影响，表现为对化疗药物Vp16的敏感性增加，促进了Vp16诱导的细胞凋亡。临床上使用的Vp16等多种化疗药物都是通过诱导细胞凋亡而发挥作用，bcl-2过度表达使白血病细胞对多种化疗药物产生耐药性。若白血病或淋巴瘤患者的bcl-2

15、表达水平较高，其病程就较为凶险5。我们的实验结果表明，反义bcl-2使细胞BCL-2蛋白降低后，细胞对Vp16的杀伤敏感性明显提高，促进了Vp16诱导的细胞凋亡。临床上对于bcl-2表达水平较高、对化疗药物产生抗体的难治性白血病，若用转录bcl-2的逆转录病毒感染患者的白血病细胞，使bcl-2的表达降低，增加其对化疗药物的敏感性，然后再进行化疗，也许会产生较好的疗效。本结果为反义bcl-2序列在临床应用提供了理论依据。参 考 文 献1Miyashita T, Reed JC. Bcl-2 gene transfer increase resistance of S49.1 and WEHI 7

16、.2 lymphoid cells to cell death and DNA fragmentation induced by glycocorticoids and multiple chemotherapeutic drug. Cancer Res, 1992, 52:5407-5411.2陈德喜，魏妤，王申五. 一种快速RT-PCR法分析培养细胞基因表达水平. 北京医科大学学报，1997， 3：280-282.3Herrmann M, Lorenz HM, Voll R, et al. A rapid and simple method for the isolation of apoptotic DNA fragment. Nucl Acid Res， 1994, 22:5505-5506.4Khokha R, Waterhouse P, Yagel S,