高效液相色谱法测定蔬菜中8种氨基甲酸酯类农药残留

1、高效液相色谱法测定蔬菜中8种氨基甲酸酯类农药残留现代食品科技ModernFoodScienceandTechnology2011,Vo1.27,No.7高效液相色谱法测定蔬菜中8种氨基甲酸酯类农药残留邵金良,黎其万,刘宏程,佴注,兰珊珊,梅文泉,杜丽娟,樊建麟(云南省农业科学院质量标准与检测技术研究所,云南昆明650223)摘要:建立了固相萃取.高效液相色谱柱后衍生荧光检测蔬菜中涕灭威亚砜,涕灭威砜,灭多威,三羟基克百威,涕灭威,克百威,甲萘威及异丙威等8种氨基甲酸脂类农药残留的分析方法.本文对测定氨基甲酸酯农药残留的分离条件,提取溶剂,洗脱溶剂,净化材料和基质效应进行了优化试验.结果显示,8

2、种氨基甲酸脂类农药在0.11.0mg,L的浓度范围内线性良好,线性相关系数为0.99943-4).99992,检出限为0.0080.01mg/kg之间.样品经乙腈提取,氨基小柱净化,采用基质加标,在0.1mgg添加水平的平均回收率为79.4119.0%,相对标准偏差2.5%l1.5%;0.2mg/kg添加水平的平均回收率为81.2%115.5%,相对标准偏差为2.8%8.1%.此方法可适用于大白菜,辣椒,茄子,番茄,菠菜,苦瓜,结球甘蓝和豇豆等样品的氨基甲酸酯类农药残留的分析测定.关键词:高效液相色谱法;柱后衍生;氨基甲酸酯类农药;蔬菜文章篇号:1673.9078(2011)7.856.860

3、Determination0fEightCarbamatePesticidesinVegetablesbyHighPLiquidChromatographyertormanceLiquitl11romatorap11rSHAOJin-Liang,LIQi-Wan,LIUHong-cheng,ER-Zhu,LANShan-shanMEIWen-quan,DULi-juan,FANJian-lin(InstituteofAgricultureQualitystandards&TestingTechnique,YunnanAcademyofAgriculturalScience,Ku

4、nming,Yunnan650223,China)Abstract:AnewmethodforthesimultaneousdeterminationofeightcarbamatepesticidesinChinesecabbage,pepper,egg-plant,tomato,Chinesespinach,bittergourd,cabbageandcowpeabyhighperformanceliquidchromatographywasdeveloped.Eightcarbamatepesticideswasextractedfromthesamplesbyacetonitrile,

5、salted,purifiedwithLCNH2columnanddeterminedbyhighperformanceliquidchmmat0graphyusingpost-columnderivatizationwithfluorescencedetector.TheproposedmethodsshowedagoodlinearitybetweenanalyticalsignalintherangeofO.11.0mg,Lwiththelinearcorrelationcoefficientsof0.999430.99992andlimitsofdetectionof0.008-0.0

6、1mg/kg.Theaveragerecoveriesobtainedfromsamplesspikedwi幽standardsatconcentrationlevel0.1megkgand0.2mg/kgwereintherangeof79.4%-119.O%and81.2%一l15.5%,respectively,withrelativestandarddeviationsof2.5%l1.5%and2.8%8.1%,respectively.Themethodwasaccurate,reliable,andCanbeusedfordeterminationcarbamatepestici

7、desinvegetables.Keywords:highperformanceliquidchromatography;postcolumnderivatization;carbamatepesticides;vegetables氨基甲酸酯是一种具有良好杀虫效果,在我国使用量较大的广谱性农药【I】.该类农药是以甲酸酯为前体化合物发展而来的农药,具有分解快,残留期短,低毒,高效和选择性强的特点,主要用于粮食,蔬菜和水果等农产品2】.近年来,随着氨基甲酸酯类农药在蔬菜栽培中的大量使用,主要施用于土壤中,防治收稿日期:2011-03-22基金项目:云南省社会发展科技计划项目(2008CD181);

8、云南省科技创新强省计划项目(2009AB002).作者简介:邵金良(1979-).男,硕士,助理研究员,主要从事农产品质量安全评价与分析测试.通讯作者:刘宏程856土壤中的多种害虫和线虫,容易导致在蔬菜中的残留,给蔬菜生产也带来新的质量问题.许多国家和地区对这类农药的残留量都制定了严格的限量标准,欧盟规定蔬菜,水果中灭多威的最高残留限量为0.05mg/kg.我国规定涕灭威(包括涕灭威砜和涕灭威亚砜),克百威(包括3一羟基克百威)在蔬菜中的限量值为0.02mg/kg.灭多威在甘蓝类蔬菜的限量值为2.0mg/kg,甲萘威在蔬菜中的限量值为2.0mg/kgL6J.目前,国家标准或行业标准方法体系中有

9、关氨基甲酸酯类农药的检测方法有气相色谱法,如SN/T2572.2010的液相色谱一质谱质谱法(LCMsMS);GB/T5009.1992003的酶抑制快速检测法NY/T761.2008现代食品科技ModernFoodScienceandTechnology2011,Vo1.27,No.7规定液相色谱法等.关于食品中氨基甲酸酯类农药残留量的分析国内外均有报道,检测方法主要有气相色谱法(GC)J,气相色谱.质谱法(Gc.MS)J,高效液相色谱法(LC)L9】,高效液相色谱.质谱法(LC.MS)noJ等.这些方法各有优缺点,由于氨基甲酸酯类化合物极性强,热稳定性较差,使用GC或GC.MS检测时常需采

10、用特殊的技术或手段以达到准确测定的目的,方法复杂1¨.高效液相色谱法检测氨基甲酸酯类农药残留具有选择性强,灵敏度高,重现性好等优点【l引.本文研究了大白菜,辣椒,茄子,番茄,菠菜,苦瓜,结球甘蓝和豇豆等8种蔬菜样品中残留的涕灭威亚砜(aldicarbsulfoxid),涕灭威砜(aldicarbsulfone),灭多威(methomy1),三羟基克百威(3-hydroxycarbo.furan),涕灭威(aldicarb),克百威(carbofuran),甲萘威(carbary1)与异丙威(isoprocarb)等8种农药的样品前处理方法和高效液相色谱分离检测条件,旨在建立同时测定蔬

11、菜中8种氨基甲酸酯类农药残留量的检测与确证方法.1材料与方法1.1材料与试验仪器1.1.1仪器高效液相色谱仪.荧光检测器(PerkinElmer200A);LCNH2SPEtubes(Supelclean,500mg/3mL);电子分析天平:AE.100型,梅特勒.托利多仪器有限公司;OrganomationAssociates氮吹仪,美国Jnc.公司;Diax900高速匀浆机(德国Heidolph公司);HY-5回旋式震荡器,河南省巩义市联合予化仪器有限公司;HH,Sl1.1数显电热恒温水浴锅,深圳市标雅科技有限公司.1.1.2材料新鲜蔬菜,包括大白菜,辣椒,茄子,番茄,菠菜,苦瓜,结球甘蓝

12、和豇豆,购自昆明市五华区江岸小区蔬菜农贸市场.1.1-3试剂乙腈(AR),二氯甲烷(AR),乙腈(HPLC,德国莫克),甲醇(HPLC,德国莫克),氯化钠(AR):550烘4h,放入干燥器内冷却后密封保存备用;0.05mol/LNaOH溶液:cat.NOCB130,Picketing;OPA稀释溶液:cat.NOCB910,Picketing;邻苯二甲醛(OPhthaladehyde,OPA)"cat.NO0120.Picketing:巯基乙醇(Thiofluor):cat.NO3700.2000,Picketing.1.1.4标准溶液标准储备溶液(1):分别准确吸取质量浓度为100

13、mg/L的涕灭威亚砜(aldicarbsulfoxide),涕灭威砜(aldicarbsulfone),灭多威(methomy1),三羟基克百威(3-hydroxycarbofuran),涕灭威(aldicarb),克百威(carbofuran),甲萘威(carbary1)和异丙威(isoprocarb)等农药标准溶液各1.0mL到10.0mL容量瓶中,用色谱纯甲醇定容,此溶液浓度为10.0mg/L,溶液避光低温保存;标准工作溶液(2):准确移取一定量标准储备溶液至10mL容量瓶中,用甲醇定容,分别配制得到0.1,0.2,0.25,0.5,1.0mg/L的标准工作液.1.1.5反应液的配制OP

14、A溶液的配制:称取100.0mg邻苯二甲醛,先用色谱纯甲醇溶解,2.0g巯基乙醇用少量OPA稀释溶液溶解,将稀释好的邻苯二甲醛溶液和巯基乙醇溶液混合,用OPA稀释溶液定容至1000.0mL,超声2.0min后备用(现配现用).1.2试验方法1.2.1色谱条件色谱柱:WatersSymmetryShieldTMC18(4.6x250mm,5Ixm);柱温:30.0;检测波长:Ex=339nl-n,Em=445nln;流动相:HzO:CH3CN;流速:1.0mL/min;进样量:10.0pL.柱后衍生条件:0.05mol/LNaOH溶液:流速,0.30mL/min:OPA溶液:流速,0.30mL/

15、min,柱后衍生温度80.1.2.2样品处理将大白菜,辣椒,茄子,番茄,菠菜,苦瓜,结球甘蓝,豇豆等蔬菜样品用食品粉碎机进行粉碎匀浆处理,准确称取25.0g试样于250mL锥型瓶中,加入50mL乙腈,用Diax900高速匀浆机匀浆80s后用滤纸过滤,滤液收集到装有81Og氯化钠的具塞量筒中,收集滤液4O50mL,盖上塞子,剧烈震荡80S,在室温下静置约30min,使乙腈相和水相分层.从具塞量筒中吸取10mL乙腈溶液于150mL烧杯中,将烧杯放在80水浴锅上加热,烧杯内缓慢通入氮气,将乙腈蒸发近干,用2.0mL甲醇:二氯甲烷(I:99)溶解残渣.盖上铝箔,待净化L1引.取SupelcleanLC

16、-NH2小柱,用5.0mL甲醇:二氯甲烷(1:99)预洗条件化,弃去淋出液,当溶剂液面达到小柱吸附层表面时,立即将上述提取液加入柱中,用甲醇:二氯甲烷(I:99)10mL洗脱,收集洗脱液于10mL离心管中,将离心管置于氮吹仪上,水浴50,氮吹蒸发至近干,用甲醇准确定容至2.0mL,经0.221有机相滤膜过滤,待测.1.2.3样品测定在优化色谱条件下,待仪器稳定后,重复进样0.2mg/L的氨基甲酸酯农药标准混合溶液,待相邻两针857现代食品科技ModernFoodScienceandTechnology2011,Vo1.27,No.7的响应值变化小于2.0%时,按标准溶液,样品溶液,样品溶液,标

17、准溶液的顺序进样,以标准品的保留时间定性,以样品溶液峰面积和标准溶液峰面积比较定量.1.2.4结果计算样品中被测氨基甲酸酯类农药残留含量以质量分数W计,单位mg/kg表示,按式(1)计算:(mg/kg)=×式中:P.标准溶液中农药的质量浓度,mg/L;A埔品溶液中被测农药的峰面积,v?s;As.农药标准溶液中被测农药的峰面积,gv?s;V1.提取溶液总体积,mL;V2一吸取用于检测的提取溶液的体积,mL;.样品溶液定容体积,mL;m.称样量,g.2结果与讨论2.1分离条件的选择为了获得最佳分离效果,考察乙腈:水作为流动相的分离效果.实验结果表明,当采用等度洗脱时,无论乙腈:水比例如何

18、,这8种组分均不能较好地分离;采用梯度洗脱时,当乙腈体积分数从25%线性递增至45%并保持时,随着洗脱能力增强,涕灭威,克百威,甲萘威和异丙威依次流出,峰面积信号也最强,且前者的峰形更对称,最佳梯度洗脱程序见表1.在优化条件下,目标化合物能与共萃取基质的干扰物分开,8种农药化合物完全分离,每个化合物的响应值均有很高信噪比,确保了方法的灵敏度和重复性.表1梯度洗脱条件ThbIe1Gradientelufionconditions2.2提取溶剂的选择在氨基甲酸酯类农药残留分析中常用的提取溶剂有乙腈,丙酮,二氯甲烷,石油醚,乙酸乙酯,甲醇等【l.选择甲醇,乙腈,丙酮,乙酸乙酯作为提取溶剂,相同实验条

19、件下,添加0.1mg/kg浓度水平进行番茄样品加标回收试验,其回收率依次为81.3%,94.1%,61.8%,67.5%.试验结果表明,使用丙酮,乙酸乙酯作为提取溶剂的回收率明显低于甲醇,乙腈作为提取剂的回收率.且乙腈提取的样品基质干扰较小,考虑到综合提取效率,选择性,与样品混合性以及溶剂化858作用和渗透能力等因素,本方法采用乙腈作为氨基甲酸酯类农药残留量的提取剂.2-3洗脱溶液的选择试验二氯甲烷与甲醇以不同比例,不同用量作为洗脱剂时对农药洗脱的影响,结果表明:甲醇体积分数为1%9%时,8种氨基甲酸酯的回收率基本稳定,但随着甲醇量增加杂质峰也明显增多,选择甲醇用量为1%.当洗脱剂用量为10m

20、L时,各农药的回收率接近100%.试验选择体积比为1:99的甲醇与二氯甲烷的混合溶剂10.0mL作为洗脱剂.2.4固相萃取净化柱的选择试验选用弗罗里硅土,C18,氨基固相萃取小柱进行空柱比较,8种氨基甲酸酯混合标准溶液经过弗罗里硅土柱净化,回收率只有65%,而经C18和氨基固相萃取柱净化,回收率为95%左右.在进行样品试验时,经Cl8固相萃取柱净化,有部分干扰;经过氨基固相萃取柱净化,回收率高且没有干扰,氨基固相萃取柱能有效地吸附有机酸和糖分,试验选用氨基固相萃取柱对样品净化.2.5基质影响研究基质对分析物的离子化具有增强或抑制效应,基质效应取决于待测化合物的种类(物化性质),基质化合物的组成

21、,基质与目标化合物的比例【】引.由于蔬菜基质成分很复杂,为了考查基质效应的大小及对分析定量结果的可靠性,对不同量的样品基质中加入相同量的农药混标,测定样品基质的量对回收率的影响.配制了含相同质量浓度的8种氨基甲酸酯农药混标(0.1mg/L),分别加入N0.0,1.0,5.0,10.0,20.0,25.0g大白菜基质中,进行提取和测定,样品基质的量分别为0,0.02,0.1,2.0,4.0,5.0g/mL,相对响应如图1.j四墨靛罂样品基质的量/(咖L)图1大白菜基质的影响Fig.1MatrixeffectofChinesecabbageonthedetectionofcarbamatepest

22、icidesbyHPLC由图1可知:当基质量增大,相同量的目标物的响应呈明显下降趋势.在试样的前处理过程中,试样中的可溶性物质可能随目标物一起提取,导致基体效应现代食品科技ModernFoodScienceandTechnology2011,Vo1.27,No.7的产生.为了减少基体效应的影响,本实验采用空用空白试样基体匹配校准曲线法来减小基质的干扰.2.6检出限和线性范围配制的标准工作溶液注入高效液相色谱仪进行测定,以质量分数为横坐标,相应的峰面积为纵坐标,线性回归得8种氨基甲酸酯类农药的标准曲线方程,相关系数及检出限.浓度在0.11.0mg/L范围内,涕灭威亚砜,涕灭威砜,灭多威,三羟基克

23、百威,涕灭威,克百威,甲萘威和异丙威等8种氨基甲酸酯类农药的线性回归方程,相关系数和检出限见表2.表28种氨基甲酸酯类农药残留的回归方程,相关系数和检出限Table2Reproducibilities,linearityandlimitsofdetection(LODs)theeightcarbamatepesticides农药回归方程相关系数检出-/(mg/kg1涕灭威亚砜Yl_1.96e+003x+7.18e+0020.999922涕灭威砜Y:2.15e+003x+4.15e+0020.998755灭多威Y=1.65e+003x+5.86e+0020.995146三羟基克百威Y-2.32e

24、+003x+3.26e+0020.996957涕灭威Y=1.58e+003x+4.13e+0020.999426克百威Y_2.16e+003x+5.36e+0020.997972甲萘威Y=I.89e+003x+6.23e+0020.998875异丙威Y=2.46e+003x+5.81e+0020.9996892.7方法的回收率和样品测定测定方法准确度可用全过程标准添加回收率来衡量1酬.采用上述建立的方法进行8种氨基甲酸酯农药在8种蔬菜样品进行的添加回收试验,称取25.0g样品,加入适量标样,使被加样品的8种氨基甲酸酯农药的浓度分别在0.1mg/kg和0.2mg/kg水平上,然后按实验最终确定的

25、方法进行提取实验,最终进样测定,实验设置5次重复,分别进行回收率和精密度的计算.空白样品,标准样品及添加回收色谱图如图2,实验结果见表3.8种蔬菜样品中8种氨基甲酸酯类农药的测定结果和加标回收率见表3.由表3可知:测定的几种蔬菜8种氨基甲酸酯类农药的加标浓度为0.1mg/kg时,回收率为79.4%119.0%;相对标准偏差(RsD)小于11.5%,加标浓度为0.2mg/kg时,回收率为81.2%115.5%;相对标准偏差(RSD):Jx于8.1%,本方法的回收率和重现性均令人满意.3结论本文选择8种有代表性的蔬菜,建立以乙腈为提取溶液,高速匀浆提取样品,氨基固相萃取柱净化,采用高效液相色谱柱后

26、衍生荧光法同时测定8种氨基甲酸酯类农药残留.优化分析条件,对大白菜,辣椒,茄子,番茄,菠菜,苦瓜,结球甘蓝,豇豆等8种蔬菜样品采取超声波提取,选择体积比为1:99的甲醇:二氯甲烷进行洗脱,并采用空白基质配标来降低基质的干扰,可以同时测定氨基甲酸酯农药残留.研究表明,此方法对多种农残同时提取,同时净化,操作简便,方法实用,具有准确度高,重现性好的优点,可用于蔬菜中多种氨基甲酸酯类农药残留量的分析.121O名54?O3?O名?.1?0-0.O2468l01214l61820222426Time,rain8种氨基甲酸酯的色谱图(浓度为0.2mg/L)2468101214161820222426Tim

27、e|min茄子空白样品色谱图Time/mln茄子添加回收率加标色谱图(加标浓度0.Img/kg)图2番茄空白样品,8种氨基甲酸酯农药的标准样品和添加回收色谱图Fig.2HPLCchromatogramsofcontrolsampleandstandardseightcarbamatepesticides注:1-涕灭威亚砜(aldicarbsulfoxid),2-涕灭威砜(aldicarbsulfone),3-灭多威(methomy1),4-三羟基克百威(3-hydroxy.carbofuran),5-涕灭威(aldicarb),6-克百威(carbofuran),7.859儿儿鸺H咖mm懈c;

28、O00c;0科技ModernFoodScienceandTechnology2011,Vo1.27,No.7甲萘威(carbary1),8-异丙威(isoprocarb).表38种氨基甲酸酯类农药的回收率及相对标准偏差tTable3Recoveriesandcoefficientvariationsofeightcarbamatepesticides农药涕灭威亚砜涕灭威砜灭多威三羟基克百威涕灭威克百威甲萘威异丙威回收率/%84.0I19.088.O89.484.393.887.699.5.,RSD/%3.86.74.65.510.84.96.53.2回收率92.394.692.491.688.

29、891.592.494.6RSD/%5.55.43.82.63.35.64.63.2''一一-.一一一一'.一.一一一一一一一一一_一一一一_一一一._一一一-一一一一一_.-'._一_一'一一一一一-一一一一+一-一一一-_._一一一一一一一一一一一一一一_一一一'-.,-_-_,一-_回收率/%88.889.792.379.495.394.689.8102.3RSD4.8lI.56.64.32.53.43.72.9辣l书L一一-.-.-.一-一-一-回收率/%91.094.691.581.690.493.291.699.4RSD/%3.82.

30、84.53.94.65.54.83.5_-_-一一一一一一一一一一一一一一-一一一-一一一一一-一_一-一一一一一'一一一-一-一一一一一一'一一_-_-_-一一_一_-_-一一一一一一_-_-一一-一一_一-一,-_-_,_一_-一回收率/%89.786.894.581.884.892.694.693.2RSD/%6.53.45.56.82.83.94.65.5回收率/%91.588.691.383.888.691.992.8105.8RSD/%4.85.74.74.83.44.35.44.9-_-_一一一一一一一一一一一一一一一一一_一-一_-'_-_-_-一_一一

31、一一_一一一一一一一一一一一一一一_一_一_一-'_,一一-一一一-_一一一一一一一一一一一一一一一一一一一-回收率84.8102.899.8l15.580.586.4108.399.4桑贮RSD/%6.63.84.55.93.65.67.24.6回收率/%89.899.491.6103.288.292.3100.591.4RSD/%4.65.26.43.24.64.75.33.4一一_一-一一一一一一一-_-_一-_-_-_-_-_-_一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一_-一_,一-_-_-_-_-一一_一回收率/%88-389.779.895.392.481.694.

32、8106.5RSD/%7.35.26.89.73.74.65.53.8回收率9O.288.681.291.495.788.592.4100.2RSD/%5.54.65.43.74.25.33.44.1一一_-_一一一一一一一一'_-_-_-_-_-_-_-_-_一一一一一一一'一一一一一一-一一一一一_-_-一_-_-_-一_-_一一一回收率1l1.71O6.786.795.O78.788_396.7l1O.6.RSD/%6.62.97.15.04.53.85.42.9舌瓜'.-一-一-一-.-一-一.-.回收率/%100.699.888.599.781.694.894

33、.1100.5RSD/%3.14.24.84.53.43.26.54.6回收率/%80.881.281.282_382.178.981.485.6.RSD/%6,65.74.36.45.92.87.35.8结球甘蓝一-一-.一:.二:一回收率/%92.488.486.589.784.388.491.499.2RSD/%8.192.43.84.55.13.45.44.5回收率/%106.087.990.086.689.4.092.092.099.5RSD/%6.77.53.98.15.94.34.66.1一回收率99.192.494.592.491.496.494.892.8RSD/%4.57.54.25.63.64.96.44.2注:表中的加标浓度为0.10mg/kg;的加标浓度为0.20mg/kg;其他7种蔬菜加标浓度类同.参考文献技,2o10(6):330_23周建科,龙望,彭静.盐