金花葵粗黄酮的提取工艺研究

1、金花葵粗黄酮的提取工艺研究化学工程师ChemicalEngineer2011年第10期玢斯铡斌文章编号:10021124(2011)10003105金花葵粗黄酮的提取工艺研究杨秀松(国家食品药品监督管理局高级研修学院.北京100073)摘要:通过对金花葵黄酮超声辅助提取工艺单因素和正交实验的研究,获得了金花葵黄酮粗提物的提取工艺参数:80C下超声30min后,用60%乙醇,料液比1:40,提取时间75min,提取1次.经分析提取液中黄酮类物质的含量,计算每克原料的黄酮提取量为56.37mg.提取液经旋转蒸发浓缩后用冷冻干燥制得黄酮粗提物的冻干粉,每g金花葵原料可得冻干粉0.097g,黄酮含量为

2、0.0562g,黄酮粗提物的得率和黄酮含量分别为9.7%和58%.关键词:金花葵;粗黄酮;提取中图分类号:R284.2文献标识码:AExtractionofcrudeflavonoidsfromAbeimoschusmanihot(L)flowerYANGXiusong(StateFoodandDrugAdministrationInstituteofExecutiveDevelopment,Bering100073,China)Abstract:BythestudiesofAbelmoschusmanihot(L)flowerflavonoidsultrasoundassistedextra

3、ctionthatUS-ingsinglefactorandorthogonaldesign,theultrasonic-assistedextractionparametersofflavonoidscrudeextractscouldbeobtainedasfollows:After80Ctemperatureultrasonic30min,ultrasonictreatmentlastedfor75minwith1:40of60%ethano1.andextractedonetime.Calculatingthecontentofflavonoidextract.wecouldseeth

4、eamountofflavonoidextractionis56.37mgpergramofrawmaterials.Flavonoidscrudeextractsconcentratedbyrotaryevaporationlaterobtaineditsfreeze-driedpowderbyfreeze-drying.Abelmoschusmanihot(L)flowerrawmaterialpergramoffreeze-driedpowderobtained0.097gandflavonoidcontentwas0.0562g,Theextractionrateofflavonoid

5、sandflavonoidcontentswere9.7%and58%.Keywords:Abelmoschusmanihotflower;crudeflavonoids;extraction金花葵又名菜芙蓉(HibiscusmanihotL.)也称野芙蓉,为1年生草本锦葵科(Malvaceae)秋葵属植物.是2003年8月被中国农科院在河北邢台地区发现濒临绝种的植物,在200多个秋葵植物中最具食用,药用,保健功能,有较高的利用价值.对金花葵的黄酮含量测定表明,金花葵黄酮含量高达5.6%(干重),是已知天然产物中含量最高者.黄酮类化合物是一类重要的并且在植物界分布广泛的天然化合物,它泛指两个具

6、有酚羟基的苯环(A一与B一环)通过中央三碳原子相互连结而成的一系列化合物.根据中央三碳链的氧化程度,B一环联结位及三碳链是否构成环状等特点,可将黄酮类化合物分为9类:黄酮,黄酮醇,异黄酮,黄烷酮,双氢黄酮醇,查尔酮,花青素,花色苷,橙酮.黄酮类化合物具有抗氧化,调节机体免疫力【引,降低心血管疾病发生41,抗炎51,降血糖等生理涪陛.收稿日期:2011-0914作者简介:杨秀松(1975一),男(汉),工程师,硕士,主要从事食品工艺和食品功能性研究.联2I811./:accrC2一苯基色原酮(黄酮类)图1生物类黄酮的基本结构Fig.1Basicstructureofflavonoids黄酮的提取

7、是指采用适当的溶剂从植物组织中将黄酮分离的过程,溶剂的选择决定于黄酮的类型和溶解性质.存在于茎杆中的黄酮,多为游离甙元,需依甙元的极性选择提取溶剂,极性大的甙元可采用极性较大的溶剂,而极性小的甙元提取,则应采用氯仿,乙醚,乙酸乙酯等溶剂提取.存在于花,叶,果等组织中的苷,由于存在配糖体,极性较大,可以使用极性较大的溶剂如丙酮,乙酸乙酯,乙醇,水提取.为促进溶剂的扩散速度,提高提取速度和效率,可采用辅助提取方法,常用的辅助提取方法有:超声波提取法,微波提取法,高压提取法,酶解法提取法,超临界流体萃取等.杨秀松:金花葵粗黄酮的提取工艺研究2011年第1O期1实验部分1.1实验材料,试剂及仪器金花葵

8、(由河北邢台市绿岭食品公司).芦丁(纯度:95.O%,中国药品生物制品检定所);乙醇,石油醚,NaOH,NaNO2,AI(NO3)3均为分析纯,北京化学试剂厂.DFF一100手提式高速中药粉碎机(温岭市大德中药机械有限公司);FA1004电子天平(上海精科天平仪器厂);超声波药品处理机(济宁金百特电子有限责任公司);RE一52旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂);SH1311I循环水式多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司);722型紫外可见分光光度计(上海精密科学仪器有限公司);LG102.4A离心机(北京医用离心机厂);DZF一6020型真空干燥箱(上海益恒实验仪器有限公司).1.2实验方法1.2

9、.1金花葵粗黄酮的提取称取一定量烘干至恒重的粉碎金花葵样品,乙醇浸泡,超声波辅助提取总黄酮.收集提取液,石油醚萃取.收集水相,浓缩至膏状,加入95%乙醇沉淀多糖等不溶物,离心除杂,收集液体,并用乙醇定容至一定体积,备用(待测液).1.2.2单因素实验1.2.2.1乙醇浓度的确定准确称取5.00g粉碎金花葵,在提取时间60min,超声温度80,料液比1:35,预浸泡时间6h,提取次数1次的情况下,分别选取乙醇浓度为50%,60%,70%,80%,90%进行总黄酮提取实验.1.2.2.2料液比的确定准确称取5.00g粉碎金花葵,在乙醇浓度70%,提取时间60min,超声温度80,预浸泡时间6h,提

10、取次数1次的情况下,分别选取料液比为1:20,1:25,1:30,1:35,1:40进行总黄酮提取实验.1.2.2_3提取时间的确定准确称取5.00g粉碎金花葵,在乙醇浓度70%,超声温度80,料液比1:35,预浸泡时间6h,提取次数1次的情况下,分别选取提取时间为15,30,45,60,75min进行总黄酮提取实验.1.2.2.4超声温度的确定准确称取5.00g粉碎金花葵,在乙醇浓度70%,提取时间60min,料液比1:35,预浸泡时间6h,提取次数1次的情况下,分别选取超声温度为40,50,60,70,80,90进行总黄酮提取实验.1.2.2.5提取次数的影响准确称取5.00g粉碎金花葵,

11、在乙醇浓度70%,提取时间60min,超声温度80C,料液比1:35,预浸泡时间6h的情况下,对原料进行3次提取.1.3正交实验根据上述单因素实验结果,选择乙醇浓度(A),料液比(B),超声时间(c),超声温度(D)4个因素设计L9(3)正交表,考察4个因素的交互作用.由正交表中9组不同组合实验,来筛选最佳的工艺条件和技术参数.各因素水平设计见表1.表1金花葵黄酮提取正交实验设计Tab.1TheorthogonalexperimentDesignofextractionofflavonoidsfromPotentillachinensisSer水平因素A乙醇浓度/%B料液比C超声时间/rain

12、D超声温度/1.4金花葵浸提物总黄酮含量的测定标准对照液的制备:准确称取经120干燥至恒重的芦丁标准品25mg,置于10mL容量瓶中,加入适量70%乙醇溶液,温热溶解,冷却,再用70%乙醇溶液稀释至刻度,摇匀.用吸量管吸取5.0mL于50mL容量瓶中,加入70%乙醇溶液至刻度,摇匀,即得0.1mg?mL-标准对照液.标准曲线的绘制:精密量取标准对照液O.0,1.0,2.0,3.0,4.0,5.0mL分别置于10mL容量瓶中,再分别向容量瓶内加70%乙醇溶液5.0,4.0,3.0,2.0,1.0,0.0mL,加5%NaNO2溶液0.3mL,摇匀,放置6min,再加入10%Al(NO.)溶液0.3

13、mL,摇匀,放置6min,加4%NaOH溶液4mL,用70%乙醇溶液定容至刻度,摇匀,放置15min,在510nm波长处测定不同浓度芦丁溶液的吸光度,以浓度为横坐标,吸光度为纵坐标,绘制标准曲线.样品测定:按照1.2.2.1所示黄酮提取步骤得到待测液.准确量取lmL待测液于10mL容量瓶中,加70%乙醇至5mL.加0.3mL5%NaNO2,摇匀,静置6min;加0.3mL10%A1(NO3)3,摇匀,静置6min;加4mL4%NaOH,用70%乙醇定容至刻度,摇匀,静置15min,在510nm处测定,样液空白为参比.黄酮类物质含量的计算:黄酮类物质含量(mg?g)=(10cA)式中c:由吸光度

14、计算出的总黄酮浓度,mg?mL-;2011年第l0期杨秀松:金花葵粗黄酮的提取工艺研究:稀释倍数;:提取液样品含量,mL;M:称取金花葵质量,g.,1.5黄酮粗提物的制备准确称取50g金花葵,以最佳工艺提取,提取液旋转蒸发浓缩,冷冻干燥即得.1.6统计方法统计学处理数据用均数标准差表示,采用SPSS13.0统计分析软件,多组间差异比较用ANOVA检验和方差分析.2结果与分析2.1总黄酮含量标准曲线以芦丁浓度为横坐标,以吸光值为纵坐标,绘制标准曲线见图2.图2总黄酮含量标准曲线Fig.2Standardcunreoftotalflavonoidscontent用Excel软件进行线性回归分析,得

15、回归方程:Y=10.477x一0.0054,RL0.9994.其中Y为吸光度,为芦丁浓度(mg?mL),R为相关系数.2.2黄酮提取的单因素实验结果2.2.1乙醇浓度的影响黄酮易溶于醇水混合物,不同浓度的乙醇水溶液中黄酮的溶解度不同,提取率也不同.为考察不同浓度乙醇的黄酮提取效果,确定最佳的乙醇提取浓度,设计了50%,60%,70%,80%和90%5个浓度.图3为不同浓度乙醇溶液对金花葵提取物总黄酮含量的影响.由图3可见,在乙醇浓度50%70%之间,随着乙醇浓度的升高,金花葵提取液中总黄酮的含量逐渐增加,在70%的乙醇浓度时达高峰;在乙醇浓度70%90%之间,随着乙醇浓度的升高,金花葵提取液中

16、总黄酮的含量逐渐下降.这可能是由于当溶质达到一定比例时,黄酮物质在溶液中的溶解已达到平衡,再增加溶质的量,只会增加杂质的溶出,导致黄提取物中黄酮含量下降.乙醇浓度,%图3不同浓度乙醇溶液对金花葵提取物总黄酮含量的影响Fig.3Effectofdifferentconsistofethanoltototalflavonoidscontentinabelmoschusmanihotflowerextraction2.2.2料液比的影响固液提取是目标成分从固体材料中扩散到提取溶剂中的过程,因此,随液一固比的增大,分散到提取液中的目标成分的稀释倍数越大.为考察不同料液比对黄酮提取效果的影响,确定最佳的

17、料液比,设计了1:15,1:20,1:25,1:30,1:35和l:406个料液比,结果见图4.料液比图4不同料液比对金花葵提取物总黄酮含量的影响Fig.4Effectoffeedliquidratiotototalflavonoidscontentinabelmoschusmanihotflowerextraction由图4可见,随着料液比的增大,总黄酮提取量逐渐增大,当料液比达到1:35时,提取量基本不再增加.表明料液比在1:35时,黄酮在物料和溶剂之间的分配趋向均衡.料液比的大小影响浸提的浓度差,浓度差越大,扩散推动力越大,越利于提高浸提效率.实验中,随着料液比的增大,总黄酮提取量逐渐增

18、大.当料液比达到1:35时,提取量达到最高值,而后提取量反而有少许下降.2.2.3提取时间的影响理论上提取时间越长,提取率越高,但时间越长,生产能耗越大,而且当提取率达到一定程度时,即使延长时间也不会使提取率明显增加,甚至有时还会降低.为考察提取时间对金花葵黄酮提取效果的影响,确定最佳的提取时间,实验设计了15,30,45,60,75,90min6个提取时间,结果见图5.0OOOO0O口0,杨秀松:金花葵粗黄酮的提取工艺研究2011年第1O期60504O30缸离20I砥1OOl53O456O7590提取时间/min图5不同提取时间对金花葵提取物总黄酮含量的影响Fig.5Effectsofdif

19、ferenttimeontotalflavonoidsofPotentillachinensisSerextracts由图5可看出,在1560min内,随着提取时间的延长,黄酮提取量也逐渐升高,60min后,提取量不再增加,反而略有下降.表明随着时间的延长,物料中的黄酮逐渐向溶剂转移,至60min达到分配平衡.60min后,提取量反而有些许下降,这是因为时间过长杂质成分溶解也随之增加,反而会降低提取效率.2.2.4超声温度的影响超声可造成植物细胞破壁,增加细胞的通透性,从而提高黄酮的提取率.影响细胞破壁的因素包括超声功能,超声时间,超生温度等,由于本实验室的超声波提取设备为固定功率的超声波提取

20、仪,因此,实验仅考察超声时间和超声温度对黄酮提取效果的影响.为考察超声温度对黄酮提取效果的影响,实验设计了40,50,6O,70,805个处理温度,结果见图6.超声温度,图6不同提取温度对金花葵提取物总黄酮含量的影响Fig.6Effectofextractiontemperaturetototalflavonoidscontentinabelmoschusmanihotflowerextraction由图6可见,温度在4O70之间时,随着温度的升高黄酮提取量逐渐增大,当温度升高到一定70C时,超声温度再升高时,黄酮的提取量基本不再增加.表明,当超声温度达到70时,金花葵花的细胞已充分破壁.温度

21、增加可增大可溶性成分的溶解度,扩散系数,并且温度适当升高,可使原料中的蛋白质凝固,酶破坏而增加浸提液的稳定性,但温度过高,会破坏提取物中的不耐热成分,并且导致浸提液的品质劣变,因此,应当选择合适的提取温度.2.2.5超声时间的影响在一定的超声功率和温度下,超声时间越长,植物细胞的破壁率越高,活性成分的提取效果越好,但当破壁率达到接近100%时,即使再延长超声时间,也不会增加黄酮的提取量.为考察超声时间和黄酮提取量的关系,实验设计了超声10,15,2O,25,30,35,40min的超声处理时间,结果见图7.6O504O瑚I加30匿粗201O0第一次第二次第三次图8不同提取次数的提取液中黄酮含量

22、Fig.8Effectofextractiontimestototalflavonoidscontentinabelmoschusmanihotflowerextraction由图8可看出,金花葵总黄酮有效成分在第一次提取时就已基本达到最大提取量,3次提取出的浸提物总黄酮含量比例约为45:2:1,一次提取已经能提取出绝大部分的目标物质.表明1次提取己基本将金花葵中的黄酮提取出来,第2,3次提取几乎没有实际意义.中草药成分复杂,有效化学成分较多,溶剂提取时,往往不能够一次就把所需有效m.暑II咖扣匿槭2011年第lO期杨秀松:金花葵粗黄酮的提取工艺研究成分提取完全,因此,在对中草药有效化学成分进

23、行提取时,一般会采用提取23次,以便充分浸提有效物质,提高中草药的利用率.而本实验中,金花葵总黄酮有效成分在第一次提取时就已基本达到最大提取量,一次提取已经能提取出绝大部分的目标物质.从成本角度如热量,试剂,时间等因素综合考虑,选取提取1次即可.2-3正交实验结果与分析2.3.1因素的选择及正交实验结果由以上单因素影响实验,得到了在各个因素改变的情况下提取效果较好的一些因素条件,从中选取4个对实验结果影响较大的因素,确立金花葵黄酮提取的因素水平表,见表3.由此设计了相应的正交表L9(3).正交实验结果见表3.表3k(3)正交试验结果Tab.3ResultsoftheL日(3)orthogonalexperiment从表3可以看出,各实验因素及其水平对金花葵黄酮类物质提取量的大小表现出一定的差异,实验各因素之间存在一定的相互作用,对金花葵总黄酮的提取产生了不同的影响.极差分析结果如下:A>C>B>D,即乙醇浓度>超声时间>料液比>超声温度.2.3.2方差分析金花葵黄酮类物质提取正交实验方差分析见表4.表4实验结果方差分析Tab.4Varianceanalysisoftheexperiment