时间分辨技术的基本知识全部整合资料

1、* *时间分辨技术的原理目前最先进的免疫检测技术：1、时间分辨原理：用三价稀土离子及其鳌合剂作为示踪物，代替荧光物质、同位素或酶，标 记蛋白质、多胎、激素、抗体、核酸探针或生物流行性细胞，当反应体系发生 后，用时间分辨仪器测定最后产物中荧光强度。根据荧光强度或相对荧光强度 比值，来判断反应体系中分析物的浓度，达到定量分析之目的。2、时间分辨原子标记物的特点：发射光和激发光有较大的 STOKES 位移一一高特异性 长寿命荧光，降低其他物质的荧光干扰一一高灵敏度 半衰期长达几十万年，试剂受干扰小 高稳定性原子标记与大分子标记物的对比原子标记物大分子标记物标记位点多个，可达 2020 个只有 1 1

2、 个对被标记物蛋白活性的影响影响小，基本无影响影响大，经常影响蛋白活性对被标记物空间结构的影响无影响，保证稳定性影响大，造成试剂的不稳定受环境因素的影响影响小影响大，温度影响3、波长分辨：标记离子的荧光激发光波长范围较宽，发射光光谱范围较窄，是类线光谱，有利于降低本底荧光强度，提高分辨率。激发与发射光之间有一个较大的 STOKES 位移，有利于排除非特异荧光的干* *扰，增强测量的特异性。4、时间分辨:标记离子螯合物产生的荧光强度高，寿命长，有利于消除样品及环境中荧光 物质对检测结果的影响。每一秒名检测样品 1000 次，取其中不受干扰的 400 次的均值作为测定值， 有利于提高检测的准确性。

3、时间分辨技术取代酶免、放免是免疫检测技术发展的必然趋势！RIA （放免）放射性（1251），对环境和身体的危害，已经为重视环保的国家逐步取消，如 整个欧洲仅尚存几个放免试验室。125I 半衰期短，导致试剂的有效期短，需每次定标，造成很大的浪费。由于标记物（125I ）的不断变化，带来药盒批间、批内较大的变异，标准曲线 无法保存备用。ELESA （酶免）灵敏度、重复性不及放免，易造成漏检和假阳性。酶的纯度和反应过程容易受环境因素影响，导致稳定性、重复性不好。与其它技术的相对优势：（1） 、是现有的免疫检测方法中灵敏度最高的（2） 、是现有的免疫检测方法中稳定性最好的（3） 、多标记检测是目前所有

4、免疫检测技术中独一无二的* *TRF 技术与电化学发光的比较时间分辨荧光电化学发光标记物四种原子：Eu,Sm,Te,DyEu,Sm,Te,Dy一种原子: :钉多标记技术有无科研项目能（10001000 多种科研项目）无试剂种类5858 种临床,24,24 种科研，共 8282 种4040 种临床，无科研试剂价格低高TRF 与化学发光的比较时间分辨荧光化学发光发光效率95%95%1%1%重复检测可无数次重复不可重复本底噪声零本底干扰大灵敏级数1010-19-191010-15-15标记物原子大分子化合物标记位点每个抗体可达 2020 个1 1 个标准曲线稳定达一年以上稳定 2 2 到 4 4 周

5、多标记有，最多可达四标记无科研开发有无* *时间分辨荧光免疫定量分析简介时间分辨荧光分析(TimeresolvedFluoroimmunoassay,TRFIA )是一种非同位素免疫分析技术， 它用镧系元素标记抗原或抗体， 根据镧系元素螯合物的发光特点， 用时间分辨 技术测量荧光，同时检测波长和时间两个参数进行信号分辨，可有效地排除非异荧光的干扰， 极大地提高了分析灵敏度。解离增强镧元素荧光免疫分析是时间分辨荧光免疫分析中的一种它用具有双功能基团结 构的螯合剂，使其一端与铕(Eu)连接，另一端与抗体抗原分子上的自由氨基连接，形底 U 标记的抗体/抗原，经过免疫反应之后生成免疫复合物。由于这种复

6、合物在水中的荧光强度非 常弱，因此加入一种增强剂，使 Eu3+从复合物上解离下来，自由 Eu3+同增强剂中的另一种 螯合剂螯形成一种胶态分子团，这种分子团在紫外光的激发下能发出很强的荧光信号增强了 百万倍。因为这种分析方法使用了解离增强步骤，因此称为解离增强镧系元素荧光免疫分析。乙肝病毒(HBV)标记物的检测方法常用测定乙肝病毒的抗原、抗体标记物，由 0 年代 末 70年代初的琼脂扩撒法，依次发展为血凝法-酶联免疫吸附(ELISA)、同位素免疫标记 (RIA)-化学发光免疫分析、生物发光、电化学发光免疫标记禾 80 年代中建立的稀土离子 荧光标记* *(时间分辨荧光免疫分析)等不同的检测方法。

7、随着科学的发展和检验技术的进步， 其方法每发展一步，乙肝标记物检出的灵敏度和准确性都得到不同的提高。时间分辨荧光免疫分析(TRF)为近年新研制成功的用三价稀土离子作为示踪物，以单克 隆抗体包被支持物与样品中抗原反应，再加入有铕(EU)标记的抗体，进行反应检测，可大 大降低一般同位素和荧光标记受环境干扰缺点，提高了检测的灵敏度和准性，该 RF 法检测 乙肝病毒标记物较其他方法灵敏度高、特异性好，干扰因素少 RF 为目前检测乙肝病毒标记 物最理想的方法。TRF 定量检测乙肝病毒“两对半”为临床诊断乙肝提供了新手段，有助于临床客观的分析HBV 感染情况、疗效的观察和转归等情况的分析，至少可对下列情况

8、更具有独特的诊断价值：1、治疗前进行病毒定量检测，可以指导选择抗病毒药物，避免盲目用药。2、治疗后定量间接判断体内病毒数量，有助于疗效的观察。3、怀孕前进行定量测定，有助于选择有利于的怀孕时机。乙肝孕妇进行定量检查，有助于使 部分病人得到及时的正确的诊断目前我科已正式开展了乙肝二对半的 TRFIA 定量分析， 其每一项的正常值范围均是由我 国卫生部根据美国雅培的标准而制定其灵敏度，准确度,及精确度都有远远优于一般的 ELISA 法，乙肝两对半的定量制定将给临床提供一个关于乙肝诊断及疗效预后判断的更可靠的实验 结果。1、 极大地提高了检测的灵敏度时间分辨荧光免疫定量技术(TRFIA)检测 Hbs

9、Ag 灵敏 度可达0.2ng/ml，而酶标(EIASA)检测的灵敏度是 2ng/ml，极大地提高检测的灵敏度。因 此，在急性乙肝早期能及早检出 HbsAg，确证 HBV 感染，缩短窗口期；其次，可发现低浓 度 HbsAg携带者；在部分慢性乙肝患者中，由于机体缺乏对 HBV 包蟆蛋白的免疫应答， HbsAg 表达较* *低，酶标检测可出现 HbsAg 和 HbsAb 均阴性的情况，TRF 技术则可避免这些情况的发生，为正确判断病情提供依据。2、能动态观察疗效和监测病情1)定量分析 HBsAg 和 HBsAb 的浓度变化，可预见急性乙肝是否处于恢复期。如HBsAg 浓度降低，HBsAb 浓度逐渐升

10、高，可说明病情正往恢复期发展；反之 HBsAg 浓度 处于较高水平或上升趋势而 HBsAb 一直处于较低水平，则易发展为慢性乙肝或病毒携带者。2)定量分析 HBeAg 和 HBeAb 的浓度变化，可反映病情变化和治疗效果。定量测 定能明确检测 HBeAg 和 HBeAb 转换的时期，即表现为 HBeAg 浓度下降和 HBeAb 升高 的过程。高浓度的 HBeAg 还可间接提示病毒处于高复制状态，具有较高传染性。高浓度的 HBeAb 一方面提示病情好转而在某些时候(如肝功能指标很差)则可能与肝坏死、肝硬化、 肝癌有关。3)HBcAb 浓度的高低可反映病毒感染的状态。高浓度的抗 Hbc 提示乙肝性

11、感染， 恢复期浓度降低。慢性乙肝呈抗 Hbc 持续高浓度。而低浓度的抗 Hbc 般为恢复期或既往 感染。4) 有利于对慢性肝炎活动性或非活动性的判断。非活动性慢性乙肝各项指标相对稳定，活动性往往呈现进行性变化。3、 TRFIA 和定量 PCR 技术可互相补充血清 HBVDNA 荧光定量 PCR 测定可以直接反映血液中病毒复制状态， 具有很多临床应 用价值，但不能完全反映病毒复制静息期肝细胞内 HBV 病毒状态oHBVDNA 阴性并不完全 代表体内 HBV 已被清除，结合“两对半”各项指标更能客观反映体 PHBV 病毒状态。4、 HBsAb 的定量测定能够对乙肝的预防起到监督作用HBsAb 的定

12、量测定能够对抗体是否真正具有“中和 HBV 的免疫力作出正确评价，对乙 肝的预防起到监督作用。HBsAb 的含量在 10mlU/ml 以上病人 ELISA 检测即可呈阳性结果，但并不提示机体都一定具有免疫力，而 HBsAb 的含量在 10 100mlU/ml 之间的样本，定性 虽* *为“阳性”但此时机体对 HBV 的免疫力较弱，甚至不能预防 HBV 感染。只有 HBsAb 的含 量达到 100mlU/ml 以上时才可确定具有抵抗 HBV 入侵的作用。作定量检测，可根据 HBsAb 的含量判断机体对 HBV 的免疫状态及乙肝苗的免疫效果因此定量测定对乙肝疫苗免疫力的评 价和高危人群预防免疫具有

13、重要意义，特别是在少年儿童预防乙肝方面。乙肝两对半定量的临床意义1、乙肝表面抗原（HBsAg）定量能极早地检出 HBsAg， 确证乙肝感染， 几乎能与 preSI 同时检测出。 在乙肝病程中大 大缩短了窗口期的时间。由于机体常缺乏对包膜蛋白的免疫应答HBsAg 表达较低， 可出现 HBsAg、 Anti-HBs 均阴性的情况，定量检测 HBsAg 则可避免这些情况的出现。病毒发生变异后，病毒表达量较低，甚至“定性”检测不出抗原。可检测出 BsAg, 并极有可能同时检测出 HBsAg、Anti-HBs。国内外学者研究表明 HBsAg 的细胞免疫应答与肝细胞损伤有一定关系血清中 HBsAg含量和病

14、人对HBsAg细胞免疫成反比关系， 而肝功能改就则与此种细胞免疫成反比而定 量检测 HBsAg 是反映这一关系的唯一手段。般来说，慢性肝炎 HBsAgCOI 相对恒定：而活动性肝炎 HBsAgCOI 往往较高且不* *稳定。2、乙肝表面抗体 Anti-HBs ）定量Anti-HBs 的定量检测能够地机体是否真正具有“中和 HBV 免疫力作为正确评价， 避 免误误导病人，对乙肝的预防起到监督作用。Anti-HBs 含理在 10 100IU/L 之间的样本，乙肝两对半定性的结果为阳性，但此时 机体对 HBV 并无中和作用，仍有感染 HBV 的危险。只有定量检测 Anti-HBs 在 100UI/L

15、 以上时才具有抵抗 HBV 入侵的作用。因此，定量检测乙肝两对半对乙肝疫苗免疫力的评价 和高危人群预防具有重要意义。3、乙能 e 抗原（HBeAg ）定量HBeAg是乙肝病毒在肝细胞在繁殖时出现的 tC/C基因的产物， 经蛋白酶水解后 HBe 蛋白质以非颗粒形式分泌入血清中。在急性 HBV 感染时，血清中可出现 HBeAg，但维持 可测水平的时间很短暂（数天一数周）HBeAg 阳性一般是提示有大量病毒存在，是急性 乙肝恢复期的首选血清学指标。由前 C 基因突变 HBV 感染所致的急性或慢性乙肝， 始终不出 HBeAg， 但 HBV-DNA 进行性复制。HBeAg 亦在高 COI 水平波动。与前

16、者 HBeAg 阳性慢性乙肝类型中的转换期 比较，两对半定性均表现为小三阳，但后者主要表现在高 BeAgCOI 值，忽高忽低的 ALT 值和 HBV-DNA 始终阳性。4、乙肝 e 抗体（Anti-HBe 定量由 HBV 野型株感染所引起的急性或慢性乙型肝炎，其自然史分为 HBeAg 阳性期和Anti-HBe 阳性期症量监测能明确出 HBeAg 向 Anti-HBe 换的时期， 即表现为 HBeAgCOI 下降 （含量降低） 和 Anti-HBeCOI 下降 （含量升高） 的过程。 因此,Anti-HBe 定量与 HBeAg 定* *量联合检测对监测 HBV 感染的病程及药物的疗效观察有很好的

17、实际意义。由前 C 基因突就株 HBV 感染所致异型慢性乙肝，由于患者始终不出现 HBeAg。因此，长期监测患者 Anti-HBe 含量对判断其预后和转归具有十分重要的价值。5、乙肝核心抗体 An ti-HBc)定量乙肝病毒由外壳 HBsAg 和内核 HBcAg 组成。乙肝病毒感染期间，一般会产生Anti-HBc，在 HBcAg 出现后即可从血清中检测到。偶尔也有nti-HBc 阴性的 HBV 感染 者，多见于免疫抑制的病人。在乙肝感染康复者 HBsAg 携带者中，Anti-HBc 可长期存在。因此，在特殊人群中开 展Anti-HBc 筛选试验对预防乙肝的传播有重要参考价值。Anti-HBc

18、定量怀其他 HBV 试验一同检测有助于乙肝感染的诊断和监测。在其他指标 缺乏的情况下(如 HBsAg 阴性)，Anti-HBc 定量可能是现存 HBV 感染的唯一指标时间分辨免疫荧光法检测乙型肝炎病毒标志物临床工作中发现少部分经酶联免疫吸附法 ELISA)检测仅乙型肝炎表面抗原 HBsAg) 和抗HBc IgG 阳性的患者，病毒含量却很高。为此，采用时间分辨免疫荧光分析法(F)对 34 例此类患者进行乙型肝炎标志物 HBV M )的检查，现将结果报道如下：一、资料与方法1 病例选择：为 2002 年 2 月至 9 月住院或门诊患者，共 34 例，男 21 例，女 13 例，年 龄558 岁，平

19、均(29.2 18.7)岁。采静脉血分离血清，用 ELISA 进行 HBV 标志物(HBV M) 检测及 HBV DNA 定量检查。留取血清置 30C保存。(1) HBsAg、抗 HBc IgG 阳性，乙型 肝炎 e抗原(HBeAg )、抗-HBs、抗-HBc IgM 阴性；(2) HBV DNA 含量104 拷贝/ml; (3) 近 3 个月未使用抗病毒药物。每人进行 2 次抗原抗体检查，结果一致。2 次 HBV DNA 检查， 结果相* *差 1 个数量级以下。2. 常规 HBV M 检测：用 ELISA 法，试剂为上海科华生物工程股份有限公司产品，按产 品说明书操作。3. HBV DNA

20、 含理测定：采用实时荧光定量 PCR 法，试剂盒购自广州中山医科大学达安 基因诊断中心。 仪器为美国 Perkin Elmer 公司 Gene Amp E5700 型 PCR 仪。 严格按说明 书操作，检测灵敏度为 103 拷贝/ml。4. TRF 法检查 HBV M :试剂为上海新波生物技术有限公司产品，采用nytest2000 时 间分辨检测仪。严格按照说明书操作。5统计分析：取 HBV DNA 含量的对数值进行成组设计的两样本均数比较，行检验。二、结果1.HBV M :用 TRF 法检查发现，34 例患者中 HBsAg、 HBeAg、 抗-HBc 阳性者 15 例，HBsAg、抗-HBe

21、、抗-HBc 均阳性者 14 例，仅 HBsAg、抗-HBc 阳性者 5 例。即用 ELISA 检查时 HBeAg 假阴性 15 例，抗-HBe 假阴性 14 例(表 1)。2. HBV DNA 含量： HBeAg 及抗-HBc 均阴性组、 HBeAg 阳性组、 抗HBc 阳性组 HBV DNA含量的对数平均值分别为 3.451.74、7.291.59、5.801.46。将前者与后两组分别 进行成组设计的两样本均数比较的 t 检验，t 值分别为 1.005、0.816, P 值均0.05，差异 无显著性。三、讨论HBV M 的变化是评估 HBV 感染后病情转归的重要依据，也是抗病毒治疗的疗效考

22、核指 标之一。通过 TRF 检查发现，大部分 ELISA 法检测为 HBsAg、抗-HBc 阳性模式的患者其实 为HBeAg 假阴性(15/34 , 44.12%)及抗HBe 假阴性(14/34 , 41.18%)。仅少部分可能 为病毒变异的结果。研究发现，HBsAg、抗-HBc 浓度显著高于正常,ELISA 及 TRF 符全率 为 100%,抗-HBs 浓度明显低于正常，两者符合率为 00%。而 HBeAg、抗 HBe 浓度仅稍 高于正常，因* *此 ELISA 易出现假阴性。目前 TRF 主要用于激素的检测。随着仪器及试剂的国产化，检测费用的降低,TRF 因其突出的高敏感性、特异性强、无放

23、射污染等特点，在 BVM 的检测中有着广泛的应用前景。作者单位：410011 长沙，中南大学湘雅二医院肝病研究中心目前我院已正式开展了乙肝二对半的时间分辨定量分析，其每一项的正常值范围均是由 我国卫生部根据美国雅培的标准而制定， 其灵敏度， 准确度， 及精确度都有远远优于一般的 ELISA法，乙肝两对半的定量制定将给临床提供一个关于乙肝诊断及疗效，预后判断的更可 靠的实验结果。时间分辨荧光免疫定量测定乙肝两对半的临床意义极大地提高了检测的灵敏度时间分辨荧光免疫定量技术 TRFIA)检测 HBsAg 灵敏度可达 0.2ng/ml,而酶标(EIASA) 检测的灵敏度是 2ng/ml,极大地提高检测

24、的灵敏度。因此，在急性乙肝早期能及早检出 HBsAg，确证 HBV 感染，缩短窗口期；其次，可发现低浓度 IBsAg 携带者；在部分慢性乙 肝患者中，由于机体缺乏对HBV包膜蛋白的免疫应答， HBsAg表达较低， 酶标检测可出现 HBsAg和HBsAb均阴性的情况,TRF 技术则可避免这些情况的发生为正确判断病情提供依 据。* *能动态观察疗效和监测病情1 ）定量分析 HBsAg 和 HBsAb 的浓度变化可预见急性乙肝是否处于恢复期如 HBsAg 浓度降低，HBsAb 浓度逐渐升高，可说明病情正往恢复期发展；反之 HBsAg 浓度处于较 高水平或上升趋势，而 HBsAb 直处于较低水平，则易

25、发展为慢性乙肝或病毒携带者。2）定量分析 HBeAg 和 HBeAb 的浓度变化，可反映病情变化和治疗效果。定量测定能明确检测 HBeAg 向 HBeAb 转换的时期那表现为 HBeAg 浓度下降和 HBeAb 升高的过程。 高浓度的 HBeAg 还可以间接提示病毒处于高复制状态具有较高的传染性高浓度的 HBeAb 一方面提示病情好转，而在某些时候（如肝功能指标很差）则可能与肝坏死、肝硬化、肝癌 有关。3）HBsAb 浓度的高低可反映病毒感染的状态。 高浓度的抗 Hbc 提示乙肝急性感染，恢复期浓度降低。慢性乙肝呈抗 Hbc 持续高浓度。而低浓度的抗 Hbc 般为恢复期或既往 感染。4）有利于

26、对慢性肝炎活动性或非活动性的判断。 非活动性慢性乙肝各项指标相对稳定,活动性往往呈现进行性变化。TRFIA 和定量 PCR 技术可互相补充血清 HBV DNA 荧光定量 PCR 测定可以直接反映血液中病毒复制状态具有很多临床 应用价值，但不能完全反应病毒复制静息期细胞内 HBV 病毒状态。HBV DNA 阴性并不完 全代表体内 HBV 已被清除，结合“两对半”各项指标更能客观反映体 PHBV 病毒状态。HBsAb 的定量测定能够对乙肝的预防起到监督作用吗？HBsAb 的定量测定能够对抗体是否真正具有“中和 HBV 的免疫力作出正确评价，对 乙肝的预防起到监督作用HBsAb 的含量在 100ml

27、U/ml 以上病人 ELISA 检测即可呈阳性结 果， 但并不提示机体都一定具有免疫力而 HBsAb 的含量在 10 100mlU/ml 之间的样本，定性虽为“阳性”但此时机体对 HBV 的免疫力较弱，甚至不能预防 HBV 感染。只有 HBsAb 的含量达到100mlU/ml 以上时才可确定具有抵抗 HBV 入侵的作用。作定量检测，可根据 HBsAb 的含量判* *断机体对 HBV 的免疫状态及乙肝疫苗的免疫效果。因此定量测定对乙肝疫 苗免疫力的评价和高危人群预防免疫具有重要意义，特别是在少年儿童预防乙肝方面。时间分辨荧光免疫分析在乙肝的应用中南大学湘雅二医院肝病研究中心教授：杨旭乙肝抗原体测

28、定是诊断乙肝最常用的方法。酶联免疫测定由于操作简便，成本低廉，敏感性和特异性较好，80 年代中期以来就成为乙肝抗原体检测最主要的方法。但是本法只能定性，作为定量测定的方法， 其重复性很差。 据观察， 不同乙肝感染者表面抗原的浓度相 8 差 0 倍,e 抗原的浓度相差 100 倍，仅用“阳性”来表示，实在太粗糙，太不科学，难以满足临床的需要。观察指标的量化是提高诊断水平的基本要求，也是科学发展的必然趋势，因此，进入 0 年代以来，国外先后推出第四代检测方法：化学发光法、电化学发光法。但是这两个方法需要 昂贵的设备，试剂成本高，难以普遍应用。为了满足临床的需要，根据国情和省情，我科瞄准抗原抗体检测

29、发展的方向 2002 年 10月引进具有世界先进水平的时间分辨荧光免疫检测仪，在省内率先建交时间分辨荧光免疫 分析（TRFIA）检测乙肝抗原抗体的新方法，我院也是国内少数应用本法检测乙肝的医院之一。 时间分辨荧光免疫分析的原理和通常的免疫测定方法基本相同，只是标记物和测定方法不同。 时间分辨荧光免疫分析以三价稀土离子（常用的是铕）及其螯合剂代替同位素、荧光素或酶， 作为标记抗原或抗体的示踪物，检测未知的抗体或抗原，用特制的时间分辨荧光仪测定最后反 应产物中荧光的强度，根据荧光强度来判断待测物质的* *浓度在免疫复合物中的稀土离子自身 可产生微弱的荧光信号，而当加入增强液以后，稀土离子从免疫复合

30、物中释放出来，受到激发 光照射时，荧光强度可增强 100 万倍。稀土离子发出性荧光不仅光度强，而且寿命长。反应 系统中许多物质也可以发出荧光，但他们的荧光的寿命极短，因此，通过简单的延时检测，就 可以将特异性荧光与非特异性荧光区别开来，所以这个方法的名称冠以“时间分辨”时间分 辨荧光免疫分析是一种超灵敏的高度特异性的检测技术是今后抗原抗体检测发展的方向其 灵敏度比化学发光和电化发光高 10 倍100 倍，比放免法和酶标法高 1000 倍以上。据我科 现场测评，其特异性、敏感性和重复性均极强，几乎没有假阴性，假阳性率低于 1%，同一 标本连续 20 次检测CVV1%，同一批 Q0 个）连续 3

31、天检测 CV= 0.9%，检测后反应板连续 3 天重复阅读CVV1%。这一方法的建立必将极大的提高我科的乙肝诊断水平，使我们对乙肝感染者的病情、预后、 病毒复制程度、 抗病毒药物的疗效等的判断更变科学。 乙肝时间分辨荧光免疫分析试剂盒 共5 项，包括表面抗原、表面抗体、e 抗原、e 抗体和核心抗体，可任选 1 项或多项，全套需 备血 3ml （不加抗凝剂），记账后（每项 45 元）标本送传染科实验室，当天下午出结果。* *时间分辨荧光免疫测定技术在 HBV M 定量检测及临床应用分析【摘要】目的研究乙肝病毒感染者血清免疫学标志物，利用时间分辨荧光免疫分析技术(TRFIA)检测其含量结果与ELI

32、SA法结果的任合程度、 灵敏度、 特异性； 了解RFIA测定 HBV-M的准确性、可行性及临床应用价值。方法分别用 TRFIA 和 ELISA 法测定 260 例随 机血清标本HBV-M 结果及含量。结果 HBsAg( ELISA)阳性 36 例，TRFIA 阳性 40 例， x2=4,Pv0.05,两法符合率 98.46%;抗-HBs(ELISA 阳,性 130 性,TRFIA 阳性 160 例,x2=30 ,PV0.01，两法符合率 88.5%; HBeAg(ELISA)阳性 17 例，TRFIA 阳性 18 例，x2=1 , P 0.05,两法符合率 99.6%;抗-HBe(ELISA

33、阳日性 86 例，TRFIA 阳性 73 例 x2=6.76 , Pv0.01, 两法符合率 90.4%; 抗-HBc(ELISA 阳性 54 例，TRFIA 阳性 72 例，x2=15.6 , P0.01, 两法符合率 91.5%;结论 TRFIA 法与 ELISA 法比较，特异性、敏感性都高,TRFIA 作用于 HBV-M 含量* *检测可为临床间接反映病毒的感染状况，同时也为临床疗效提供动力学观察及 接种乙肝疫苗提供依据。关键词 HBV-M 时间分辨荧光免疫分析技术酶联免疫吸附试验【文献标识码】A【文章编号】1606-8106 (2004) 06-0486-02The time-reso

34、lved fluoroi mmuno assay TRFIA used in theHBV-M rati on test and the an alysis on cli nical applicati onCai Y iheDepartme nt of Laboratory,Chaozhou Cen tral Hospital,Gua ngdon g521021.【Abstract Objective to study the substanee of blood immunity HBV-M,Applyi ng,thetech no logy of TRFI-A to test the r

35、esult and the n compare itwith the result of the ELISA infixness,sensivity and specificity and to compre-hcnd the accuracyfeasibility and the value ofclinical application in testing HBV-M by TRFlA.Metfods to deter-mi nate the result and contentof260a nd HBV-M by TRFIA and ELISA respectirely.Results

36、HBsAg positre is36by ELISA,and40by TRFIA, x2=4,Pv0.05,the fix rate is98.46%;anti-HBs positive is130by ELISA,and160byTRFIA, x2=30 , P 0.05; the fix rate is99.6% ; Anti-HBe positive is86by ELISA,and73by TRFIA,x2=6.76 , P 0.01 , the fix rate is90.4%; Anti-HBc positive is54by ELISA,and72by TRFIA,x2=15.6

37、 , P0.01, the fix rate is91.5%.Con-clusion TRFIA has higher specificity and sensitivity tha n ELISA,TRFIAin test ing HBV-M co ntent may in directly n eflect the virus in fecti onin cli ni cal and offer dyn amics observati on in the cli ni cal iffects and basis in ino culati on a-gainst HBV.* *Key wo

38、rds HBV-M TRFIA ELISA时间分辨荧光免疫测定技术在HBV-M 定量检测及临床应用分析目前国内临床实验室最常用的乙型肝炎病毒 HBV）感染者的血清学标志物检测主要靠ELISA 法，由于 ELISA 法简单、方便、快速的优点在临床得到广泛应用，但受方法学本身的 限制，它不能提供 HBV-M 的具体含量，只能作为阴阳性判断，故不可能完囲 BV 感染的 动力学观察， 而时间分辨荧光免疫技术的出现提供了对 HBV-M 进行定量检测的手段。 本文 采用 TRFIA法对 260 份血清标本进行 HBV-M 检测，并与 ELISA 法结果进行比较和分析。 现报告如下：1 对象与方法1.1 对

39、象血清标本均来自本院门诊及住院病260 例，无年龄性别要求。早晨空腹抽取 静* *脉血，分离血清后产即检测。1.2 检测试剂 ELISA 试剂盒由上海荣盛生物技术有限公司提供TRFIA 试剂盒由广州市 丰华生物工程有限公司提供。1.3 仪器 EL-312e 酶标仪。泰莱-1 时间分辨荧光分析仪。Egate2310 全自动洗涤。2510 变频振荡器。1.4 质控物由卫生部临床检验中心提供。1.5 方法 ELISA 法和 TRFIA 法测定 HBV-M，严格按照试剂操作规程操作，同时加入相 应质控物监测。1.6 统计学方法采用配对 X2检验。2 结果2.1HBsAg ELISA法结果阳性36例，

40、阳性率13.8%; TRFIA法结果阳性40例， 阳性 率15.4%;两法都阳性 36 例，两法都阴性 220 例，TRFIA 阳性而 ELISA 阴性 4 例，TRFIA 阴性而 ELISA阳性无， 采用配对 X2检验， x2=4,Pv0.05， 差异有显著性， 两法比较符合率 为 256/260=98.46% ;其中 HB-sAg 含量 0.55ng/ml 占 4 例,625ng/ml 占 7 例,26 50ng/ml 占 8 例， 51 50ng/ml占 8 例，150ng/ml 以上占 13 例。2.2 抗-HBs ELISA 法结果阳性 130 例， 阳性率 50%; TRFIA 法

41、结果阳性 160 例， 阳性率 61.5%;两法都阳性 130 例， 两法都阴性 100 例， TRFIA 阳性而 ELISA 阴性 30 例， TRFIA 阴性而 ELISA阳性无，采用配对 x2检验，x2=30,P0.05，差异无显著性，两法比较符合率 为259/260=99.6% ;其中 HBeSg 含量 0.030.1NCU/ml 占 1 例，0.11 0.5NCU/ml 占4 例，0.51 2NCU/ml11 例，2.1 8NCU/ml12 例。2.4 抗-HBe ELISA 法 结果阳性 86 例， 阳性率 33%; TRFIA 法结果阳性 73 例， 阳性率 28%;两法都阳性

42、67 例，两法都阴性 168 例，TRFIA 阳性而 ELISA 阴性 6 例，TRFIA 阴性 而 ELISA阳性 19 例，采用配对 X2检验,x2=6.76,Pv0.01，差异有非常显著性，两法比较 符合率为235/260=90.4% ;其中抗-HBe 含量 1.52NCU/ml14 例，2 .1 5NCU/ml14 例，5.1 10NCU/ml23 例，20NCU/ml 以上 24 例。2.5 抗-HBe ELISA 法结果阳性 54 例，阳性率 20.8%; TRFIA 法结果阳性 72 例，阳性 率27.7%;两法都阳性 52 例，两法都阴性 186 例，TRFIA 阳性而 ELI

43、SA 阴性 20 例，TRFIA 阴性而 ELISA 阳性 2 例，采用配对 X2检验，x2=15.6,Pv0.01，差异有非常显著性，两法比 较符合率为 238/260=91.5% ;其中抗-HBe 含量 0.1 0.5NCU/ml11 例,0.51 1NCU/ml1 例，1 5NCU/ml10 例，5.1 10NCU/ml36 例，10NCU/ml 以上 14 例。3 讨论TRFIA 法检测 HBV-M 与 ELISA 法相比，其特异性和敏感性都高，特别是能够检测低浓 度HBsAg 和 HBeAg,对减少 HBV 感染漏诊和误诊具有较高价值。因 HBsAg 阳性是 HBV 感染的金标准。有

44、学者对血清呈低水平存在、血清 HBsAg 约在 5ng/ml 以下者做过研究】2】，对象是非肝炎患者住院人群结果是占总人群的 2.34%,占 HBsAg 阳性人群的 23.16%。 而本文只检测出 1.5%和 10%。此结果存在一定差异，有待进一步探讨。拥 Bs 是对 HBV 的保护性免疫指标，有学者认为仍有保护作用的最低掏 Bs 的浓度为 10mIU/ml，提出基 础免疫后高度抗体滴度的再接种方案最后一次接种后 4 周，如抗-HBsv10mlU/ml 立即再 接种；10100mlU/ml , 3* *6 个月后必须再接种。实际工作中发现抗 HBs 定量检测对 于监测、指导肝移值中乙型肝炎免疫

45、球蛋白的应用具有肯定作用。说明了对抗 Bs定量的 检测是很有必要的，同时也可了解人体是否有抗 HBs、是否有足够的量可抵御 HBV 的侵袭。 本文抗-HBs 结果显示,160 例 TRFIA法阳性 79 例，抗HBs 浓度值在 10100mlU/ml 以 内，此量因无确切的抵御能力，建议加强预防措施。对于 IHBs 阴性的人群更应做好预防， 至于 100mIU/ml 以上含量的人群，说明他们已有好的抵御能力。另外结果提示 ELISA 法 的抗-HBe 阳性率明显高于 TRFIA 法，由于本身方法学的限制，最好在发出报告时加以综合 分析或提高 Cutoff 值。从实验结果表明 HBV-M 各项阳

46、性结果都显示了不同的含量说明了人体感染 HBV 后， 病毒的复制程度或经抗病毒药物治疗后,HBV-M 含量也随之变化，提示了动力学关系。据 所掌握的资料观察，患都治疗前及治疗后 HBV-M 含量变化结果比较。见表 1。表 1 2 例病人 HBV-M 治疗前后结果比较 略可以看出，HBsAg 和 HBeAg 逐渐下降，而所有抗体逐步增高，这说明抗病毒治疗是 有效的，同时也给临床预后判断提供了依据。目前临床上对检测 HBV-M 的血清常用方法是血清免疫学检测，也就是检测患者对病 毒侵染机体产生的免疫反应，因此免疫血清学指标可间接反映病毒的感染状况。随着检测水 平的不断提高，TRFIA 技术的问世给

47、免疫自身的研究和发展提供了新的手段。虽網 NA 是 直接反映病毒本身在机体内的存在情况，而人们越来越意识到两者既相关，又不尽一致，高 灵敏准确的HBV-M 定量结果可与 HBV-DNA 的检测相互印证,给临床提供更客观有效的实 验报告，临床上需要将两者结合起来对患者进行综合诊断、治疗和预后等判断。如果在没有 开展 HBV-DNA 项目检测的单位，HBV-M 含量检测其本身也就是一个很好监测病毒动力学 变化的辅助指标。参考文献* *1、 陈紫榕，病毒性肝炎，北京：人民卫生出版社2002, 6, 191.2、 陈瑜，钟步云，徐根云，等低水平血清乙肝病毒表面抗原测定及临床意义。中华检测 医学杂志，2

48、001, 24： 1.3、 Klaus-peter Maier 著，郝连杰等译第四版；北京人民卫生出版社，1997, 8, 35。作者单位：521021 广东省潮州市中心医院检验科关于乙肝病毒标记物“两对半”定量测定和肝功能（肝纤维化）检测的通知各临床科室：为增加我院临床诊断、治疗和观察病情的参考依据，进一步提高我院的医疗水平和我院的综合竞争能力。我们要积极开展应用技术、新项目。最近检验科在院领导的大力支持下引进了 WALLAC 公司生产的时间分辨荧光免疫分析系统，该时间分辨荧光免疫分析系统可进行多种检测（见附录）其中对“乙肝两对半”可进行准确的定量测定。欢迎各临床科选用医务科* *2002

49、年 12 月25 日一、两对半定量测定乙肝病毒（HBV）标记物的检测方法常用测定乙肝病毒的抗原、抗体标记物，由 0 年代末 70年代初的琼脂扩撒法，依次发展为血凝法-酶联免疫吸（ELISA）、同位素免疫标记（RIA） -化学发光免疫分析、生物发光、 电化学发光免疫标记禾 80 年代中建立的稀土离子荧光标 记 （时间分辨荧光免疫分析）等不同的检测方法。随着科学的发展和检验技术的进步，其方 法每发展一步，乙肝标记物检出的灵敏度和准确性都得到不同的提高（其中 RIA 为 10-12mol/L、ECL 10为 10-19mol/L、CLIA 为 10-15m ol/L、ECL10 为-17/L、TRF

50、 为 10-19mol/L ）。其中时间分辨荧光免疫分析 TRF）为近年新研制成功的用三价稀土离子作为示踪 物，以单克降抗体包被支持物与样品中抗原反应，再加入有铕 EU）标记的抗体，进行反应 检测,可大大降低一般同位素和荧光标记受环境干扰缺点提高了检测的灵敏和准性，该 TRF 法检测乙肝病毒标记物较其他方法灵敏度高、特异性好，因干扰因素少可大地优于以上各种 方法，可与 HBV-DNA 的检测相比（未经规范化要求开展的 HBV-DNA 检测，多年的临床 实验证明，假阳性、假阴性率较高，重复性差，且不能定暈。TRF 为目前检测乙肝病毒标 记物最理想怕方法。TRF 定量检测乙肝病毒“两对半”为临床诊

51、断乙肝提供了新手段，有助 于临床客观的分析 HBV 感染情况、疗效的观察和转归等情况的分析，至少可对一列情况更 具有独特的诊断价值：1、 治疗前进行病毒定量检测，可以指导选择抗病毒药物，避免盲目用药。2、治疗后定量间接判断体内病毒数量，有助于疗效的观察。3、怀孕前进行定量测定，有助于选择有利的怀孕时机。乙肝孕妇进行定量检查，有 助于使部分病人得到及进的正确的诊断 二、两对半定量与定性组合测定今后检验科对乙肝“两对半”检查，可给临床提供两种选择，一种是乙肝病毒项定 量测* *定；另一种是定量与定性组合检查，即在乙肝“两对半”的五项检查中 HbsAg （表面 抗原）、抗-HBs （表面抗体）、，H

52、beAg （E-R 抗原）此 3 项重要的指标中必须有一项是定量 的（其余 4 项定性；也可选择其中 2 项做定量，其余 3 项做定性）。任上临床根据病人的经 济情况选择，但如果临床不注明，检验科一律做 HbsAg 定量与其余 4 定性检查。5 项定量 测定收费 105元，1 项定量与其余 4 项定性检查收费 45 元。此举意义1使“两对半”检查得到更加准确的结果与及更好解释和发挥“两对半”检查 的临床意义；2使临床检查“两对半”有更多、更切合患者利益选择，如病人经济许可，可 选择5 项定量测定，如果经济困难即可注明选择其中项与其它 4 定性检查。馬此种组合合 理，检查意义大，符合国家循征医学

53、的要求。（“两对半”定量检查，收费 105 元，如同时做生化全套，开检验单时请分开单，如“两对半”为 1 项定量其余 4 项为定性检查在一张检验单同时申请即可、南通医学院论著甲胎蛋白、癌胚抗原时间分辨荧光法与化学发光法比较王桂莲朱利国黄飚蔡刚明谭成金坚单位：江苏省江原医院，无锡 241063关键词：时间分辨荧光免疫分析；化学发光免疫分析；甲胎蛋白；癌胚抗原摘要DTPA 法制备了 Eu3+标单抗，采用夹心法建交了 AFP 和 CEA IFMA。它们的灵敏度分别为 43ng/L 和 90ng/L ;批内 CV 为 1.599%和 1.36% ;批间 CV 为* * * *7.139%和 2.89%

54、:平均回收率为 103.98%和 92.78%。与 CLIA 进行临床应用比较显 示结果高度相关(AFP r=0.9040,CEA r=0.9705 )。中图分类号0657.9文献标识码A文章编号1000-2057(2000)02-0159-01甲胎蛋白(AFP)和癌胚抗原(CEA 是迄今较为肯定的肿瘤标志物，忆广泛用于临床肿瘤诊断， 两者的检测已有 RIA、 EIA 和 IRMA 等方法。 近来发展的时间分辨荧光和化 学发光测量技术， 信噪比较高， 分析灵敏度超过了上述方法】2o我们在完成了 AFP、CEA和 IRMA 工作的基础上，采用时间分辨荧光测量技术，建交了时间分辨免疫荧光 分析(T

55、ime-resolved Immunofluormetric assay,IFMA),并与化学发光免疫分析(Chemiluminescenee Immunoassay,CLIA )进行比较。1 材料与方法1.1 试剂与设备抗 CEA 单抗 C17和 C50,抗 AFP 单抗 137#和 47#由无锡市第二制药厂提供。 Eu3+标记盒(1244-302 ), Eu3+发光增强液(B118-110 )、 AFP 和 CEA参考标准，EG&G-Wellac 产品。二乙烯三胺五乙酸酐(DTPA), Sigma 产 品。PD-10和 Sepharose CL-6B,Pharmecia 产品。CA

56、-19-9、CA-12-5 和 CA-15-3 参考标准，AFP 和 CEA CLIA 药盒，CIBA-CORNING 产品。牛 IgG 自制。去离子超 纯水由本室采用 Barnsteed 公司超纯水器(D7033)制备。96 孔微扎板，Nunc 产 品oBSA,上海生物制品的产品。其他试剂均为国产分析纯。全自动 IFMA 检测仪(AutoDELFIA1235)为 EG&G-Wellac 产品。全自动CLIA检测仪(ACS180)为* * * *CIBACORNING产品。1.2方法1.2.1CEA IFMA (1)固相 C17和 Eu3+-C50制备：将 C17单抗用5 0nmol/

57、LNa2CO3-NaHCO3Ph9.6 释至10mg/L。每孔加 200ul,4C放置过夜 oEu3+-C50制备参照 Eu3+标记盒进行。每个 C5 0lgG 上连接了 13 个 Eu3+, 产率达 52.6%。(2)测定方法：用含 8mmol/LNaCI,0.1%BSA,0.2%牛 IgG,50umol/LDTPA,0.1ml/LTween-80 和 0.1%NaN3的 50mmol/L Tris-HCI ph7.8为反应冲液，以含 14.5 水 mmol/L NaCI,0.2ml/L Tween-80 和 0.2%NaN3的上述缓冲液为洗涤液采用固相二步顺序夹心法建立 CEA-IFMA,

58、即在包被有 C17的 96孔微孔板上,每孔依次加入 25ul CEA 参考标准或待测血清及 200ul 反应缓冲 液,37C振荡孵育 2h 后，用洗涤液洗 4 次。再加 200ul1:1000 稀释的 Eu3+-C50, 37C孵育 1h， 洗涤 6 次， 加入增强液 200ul,370170 反应 5min,荧光检测。 全部 过程在 AutoDELFIA1235 上自动完成。1.2.2 AFP IFMA (1)固相 C47和 Eu3+-C137制备：方法同上，每个 C137IgG上连接了 7.52 个 Eu3+，产率达 53.07%o(2)测定方法：反应缓冲液和洗涤液同上。采用固相二步顺序夹

59、心法建交 AFP-IFMA, C47包被板每孔依次加入 25ulAFP 参考标准或待测血清及 200ul 反应缓冲液,37C孵育仆后， 加 200ul : 1000 稀* * * *释的 Eu3+-C50，孵育 1h。后续方法同上。* *123 CEA 和 AFP CLIA 参照药盒说明书，全部过程均在 ACS180 上自劝完成。2 结果2.1CEA IFMA 以零剂量测量结果均值加上 0.2S 代入标准曲线分析,CEA IFMA 的灵敏度为 90ng/L ； AFP 对本法无交叉反应，CA-19-9 的交叉反应可达 2.81% ； 方法的批内和批间 CV 分别为 1.36%和 2.89%。平

60、均回收率为 92.78%，可测范 围为 1.45 508.9ug/L。2.2 AFP IFMA 以零剂量测量结果均值加上 0.2S 代入标准曲线分析,AFP IFMA 的 灵敏度为 43ng/L ; CEA、CA-12-5、CA-15-3 和 CA-19-9 对方法无交叉反应； 方法的批内和批间 CV 分别为 1.599%和 7.139%。 平均回收率为 103.98%;可测 范围为 4.221210ul/L。2.3 IFMA 与 CLIA 同步比较 137 例正常人经 CEAMA 和 CLIA 测量，结果高度相 关(r=0.9705)。148 例正常人经 AFP IFMA 和 CLIA 测量，结果相符(r=0.9040 )。3 讨论以