人源性单克隆抗体AT4对卵巢癌ao1017细胞的细胞毒性作用

1、    人源性单克隆抗体AT4对卵巢癌ao10/17细胞的 细胞毒性作用*        摘要目的和方法：本研究应用MTT比色法分析人源性单克隆抗体（HMcAb）AT4对于人卵巢癌细胞ao1017的体外细胞毒。结果：HMcAb AT4 能激活人和家兔血清补体介导的ao1017细胞的细胞溶解，介导人效应细胞对于靶肿瘤细胞的抗体依赖细胞毒，增强人LAK细胞对于ao1017细胞的杀伤作用。结论：HMcAb AT4在体外可介导对于人卵巢癌细胞的抗体依赖效应细胞的细胞毒和补体

2、依赖细胞溶解，因而可能成为卵巢癌免疫治疗研究特别有希望的试剂。主题词抗体，单克隆；抗体依赖细胞细胞毒性；补体；杀伤细胞，淋巴因子激活；卵巢囊肿 Cytotoxicity of human monoclonal antibody AT4 against culturedhuman ovarian cancer cells ao10/17WU Shu-Yun， WEN Gan-Sheng， XU Fang-Yun， LIU Qiu-Ru， GONG Wen-Hua， YU YingDepartment of Pathophysiology and Tumor Immunology Research

3、,Jiangxi Medical College,Nanchang （330006）Abstract AIM and METHOD: The in vitro cytotoxicity of human monoclonal antibody (HMcAb) AT4 against human ovarian cancer cells ao10/17 was analysed by using MTT colorimetric assay. RESULTS: HMcAb AT4 activated human and rabbit complement-mediated cytolysis o

4、f ovarian cancer cells ao10/17, mediated antibody- dependent cytotoxicity of human effector cells aganist ao10/17 cells and enhanced the cytotoxicity of lymphokine-activated killer cells against ao10/17. CONCLUSIONS: HMcAb AT4 did mediate antibody-dependent cytotoxicity of effector cells and complem

5、ent-dependent cytotoxicity, against cultured ovarian cancer cells, and therefore it seems to be especially promising in the immunotherapy of human ovarian cancer.MeSH Antibodies, monoclonal; Antibody-dependent cell cytotoxicity; Complement; Kill cell, lymphokine-activated； Ovarian cysts杂交瘤技术及其所产生的单克

6、隆抗体（monoclonal antibody,McAb）为肿瘤的诊断和治疗带来了极大的机遇。由于卵巢癌细胞表达许多高水平的抗原，因此，卵巢癌病人已被作为McAb治疗的主要研究对象之一13。最近，我们采用体外免疫和DNA转染相结合的技术路线，制得了抗卵巢癌人源性单克隆抗体(human monoclonal antibody,HMcAb )AT4，它能与人体组织和血清中的卵巢癌相关抗原发生免疫反应4,5。本文报道应用四甲基偶氮唑盐（3-（4，5-dimethylthiazol-2-yl）-2，5-diphenyl terazolium bromide，MTT）比色法分析HMcAb AT4 对人卵

7、巢癌细胞的体外细胞毒，为HMcAb AT4的体内应用提供实验依据。材料与方法一、主要试剂和仪器：RPMI 1640为Gibco公司产品。小牛血清和MTT为上海华美公司出售。96孔细胞培养板为Costar公司产品。酶标仪为南京华东电子管厂产品。二、HMcAb：将本室采用体外免疫和DNA转染构建的分泌HMcAb AT4的永生化淋巴细胞系培养于含10小牛血清RPMI 1640培基中，取其培养上清作为HMcAb AT4 的来源。三、细胞和细胞株：人脾细胞：来自一附院外科脾破裂患者手术切除脾组织，制成悬浮细胞。LAK(lymphokine-activated killer）细胞：常规分离外周血单个核细胞

8、（peripheral blood mononuclear cells,PBMC），活细胞大于95。以2×109L细胞浓度置于含5×105UL 白介素-2（interleukin-2，IL-2）和15小牛血清的RPMI 1640培基中，37、5CO2孵育箱中培养5d后为LAK细胞。小鼠巨噬细胞：来自BALBc小鼠腹腔磷酸缓冲盐水（phosphate buffered saline，PBS）冲洗液。ao1017人卵巢癌细胞株：引自中国科学院细胞生物学研究所细胞库，在含10小牛血清的RPMI 1640培基中贴壁生长，乙二胺四乙酸（ethylene diaminetetraace

9、tic acid,EDTA）处理后，滴管吹下，经PBS洗涤后，悬于含5小牛血清的RPMI 1640培基中备用。四、MTT法：按Mosmann的方法并加以改良。五、补体依赖性细胞毒作用（complement-dependent cytotoxicity，CDC）：将体外培养的人卵巢癌细胞ao1017以109L（10 L孔）接种于96孔细胞培养板，加入未稀释的含HMcAb AT4 的培养上清（50 L孔），37孵育30 min；加入1/4和1/8稀释的人或兔血清（50 L孔）。设不加抗体和补体的对照组。每组均为4个平行孔。置37，5CO2孵育箱中培养4h、24h。实验终止前4h加入MTT（5gL）

10、10 L孔，继续培养4h；用10 SDS-0.01 mol/L HCl终止反应。590 nm波长测OD值，按下列公式计算细胞杀伤率：六、抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用（antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，ADCC）：在96孔细胞培养板中，实验组加入ao1017（109L）10 L孔和未稀释的含HMcAb AT4 的培养上清液50 L孔，37孵育30min；加入效应细胞（1010个L）50 L孔；设效应细胞对照组和靶细胞对照组。每组做4个平行孔；置于37、5CO2孵育箱中培养4h、24 h、48 h。终止前4 h加MTT，继续培养4 h；1

11、0SDS-0.01 mol/L HCl溶液终止反应。590 nm波长测OD值。按下列公式计算细胞杀伤率：杀伤率1(实验组OD值效应细胞对照组OD值)/靶细胞对照组OD值×100结果一、HMcAb AT4 介导的补体依赖细胞溶解：用人卵巢癌细胞ao1017和人与家兔血清补体分别测定HMcAb AT4 的补体依赖细胞毒（CDC）；结果如表1所示，在作用时间4h或24 h时，HMcAb AT4 均介导补体依赖ao1017细胞溶解。表1人源性单克隆抗体AT4介导的补体依赖细胞溶解Tab 1 Complement-dependent cytolysis mediated by HMcAb AT

12、4Group Culture duration(h)424(1) ao10/17 +AT4+HC (1:4)26.38% 34.18%(2) ao10/17 +AT4+HC (1:8) 28.87% 42.77%(3) ao10/17 +AT4+RC (1:4) 32.68% 22.12%(4) ao10/17 +AT4+RC (1:8) 36.85% 29.75%     ao10/17=ovarian cancer cell line； AT4 = human monoclonal antibody against ovarian cancer ；

13、HC=human complement；RC=rabbit complement 二、HMcAb AT4 介导人效应细胞的细胞毒性作用：用人卵巢癌细胞ao1017和人脾细胞测定HMcAb AT4 的抗体依赖细胞介导的细胞毒（ADCC）；作用时间为4 h、24 h、48 h。结果如1所示，特异性抗体依赖性细胞溶解的发生呈时间依赖关系。靶肿瘤细胞的特异性溶解时间在48h最大，达100。     Fig 1 Antibody-dependent human and mouse effector cell cytotoxicity mediated by HMc

14、Ab AT4 (<"Image76 (855 bytes)" src="/med/cano/201003/20100310163143119" 13 22>±s,n=4)*P0.01，vs mouse effector cell group 1HMcAb AT4介导的抗体依赖人和小鼠效应细胞毒三、HMcAb AT4介导的鼠效应细胞的细胞毒作用：用ao1017和鼠巨噬细胞测定HMcAb AT4 介导的ADCC。结果如1所示，特异性抗体依赖性细胞溶解作用在4h和48h均不发生，在24 h时杀伤率仅为7.1，与人效应细胞相比，在统计学上有

15、非常显著差异（P0.01）。四、HMcAb AT4 对LAK细胞介导的细胞毒的增强效应：结果如2所示，LAK细胞加HMcAb AT4组的杀伤率在4 h时为73.53，比LAK细胞组的杀伤率60.09高13.44（P0.05）；在24 h时LAK加HMcAb AT4 的杀伤率为100，比LAK组的杀伤率70.98高29.02（P0.01）。     Fig 2 Augmentation by HMcAb AT4 of LAK cell mediated cytotoxicity (<"Image76 (855 bytes)" sr

16、c="/med/cano/201003/20100310163143119" 13 22>±s)*P0.05，*P0.01，vs LAK group 2 HMcAb AT4对LAK细胞介导的细胞毒的增强作用讨论目前，肿瘤相关抗原McAb的体外效应与其在体内的作用的关系还不十分了解。但有证据提示，它们对于人体肿瘤的生长抑制和破坏可能发挥重要作用。大量临床前动物实验表明，人体肿瘤移植物的生长抑制作用，只在具有细胞毒的鼠McAb的介导下才能达到6。Dyer等7用大鼠抗体对恶性淋巴瘤病人进行临床试验表明，只有体外介导ADCC的抗体才有效排除肿瘤和骨髓中的肿瘤细胞。从

17、此可看出，ADCC似乎是McAb抑制人体肿瘤生长的至关重要的一种功能。Liu等8报道，抗B淋巴细胞抗原CD20鼠抗体2H7不能介导ADCC和CDC，但其与人1恒定区所构建的嵌合抗体则能激活这两种功能。Mueller等报道9，人鼠嵌合抗体CH14.18介导人效应细胞对于黑色素瘤细胞的抗体依赖细胞毒的效率比鼠McAb14.G2a高50100倍；由于鼠抗体的Fc段不象人的那样有效地活化效应细胞。但CH14.18和14.G2a两者都能活化人补体介导的靶肿瘤细胞溶解。LAK细胞与抗癌McAb的联合应用是当前颇受重视的抗癌免疫治疗策略。但McAb对于LAK细胞毒的加强作用尚未完全确定。最近，Schmoll

18、ing等10报道，用鼠McAb B72.3治疗31例卵巢癌病人，在手术和化疗后，反复（平均4次）注射1mg McAb，其中19例有临床疗效,并表现体液免疫反应。本研究发现：HMcAb AT4在体外能活化人和家兔血清补体介导的靶肿瘤细胞溶解；能介导人效应细胞对于靶肿瘤细胞的抗体依赖细胞毒，而几乎不能介导鼠巨噬细胞的细胞毒；能增强LAK细胞对于靶肿瘤细胞的细胞毒。上述结果表明，HMcAb AT4能介导对于卵巢癌细胞的补体依赖细胞溶解和抗体依赖人效应细胞介导的细胞杀伤作用，因而可能成为人卵巢癌免疫治疗研究特别有希望的一种新试剂。* 国家自然科学基金（39460031）和江西省自然科学基金（94516

19、）资助作者单位:江西医学院病理生理教研室、肿瘤免疫研究室 （南昌 330006）参考文献1 Rubin SC.Monoclonal antibodies in the management of ovarian cancer.Cancer,1993,71:1 602.2 Wagner U. Antitumor antibodies for immunotherapy of ovarian carcinoms. Hybridoma,1993,12:521.3 Schmolling J, Reinsberg J, Wagner U, et al. Antiidiotypic antibodies

20、in ovarian cancer patients treated with the monoclonal antibody B72.3. Hybridoma,1995,14:183.4 邬淑云，温淦升，徐方云，等. 人源性单克隆抗体识别的血清卵巢癌相关抗原. 江西医学院学报. 1998，38（1）：1. 5邬淑云，温淦升，徐方云，等. 卵巢癌组织表达人源性单克隆抗体识别的肿瘤相关抗原. 江西医学院学报. 1998，38（2）：1.6 Reisfeld RA, Cheresh DA. Human tumor antigens.In: Dixon FJ. ed. Advances in immunology. Vol 40. New York: Academic Press,1987. 323.7 Dye