反义端粒酶RNA对SMMC7721肝癌细胞系的作用

1、反义端粒酶RNA对SMMC7721肝癌细胞系的作用摘要目的观察反义端粒酶RNA对SMMC-7721肝癌细胞系的作用，探讨抗端粒酶治疗在原发性肝癌治疗中的意义。方法采用脂质体介导的方式将潮霉素抗性的反义端粒酶RNA真核表达载体PBBS212/hTR转入SMMC7721肝癌细胞中，经潮霉素筛选，克隆细胞株扩增鉴定后，采用TRAP-PCR-ELISA及FCM、电镜检测反义端粒酶RNA对SMMC-7721细胞端粒酶活性和细胞凋亡的影响。结果TRAP-PCR-ELISA法检细胞端粒酶活性的检测结果为：实验组吸光度值为0.482，对照组吸光度值为2.861；FCM检测细胞凋亡结果为：实验组13.8%，对照

2、组未见有凋亡峰形成，电镜观察发现转染反义端粒酶RNA的SMMC7721细胞具有典型的凋亡细胞形态，细胞发生较多的凋亡。结果表明反义端粒酶RNA显著抑制SMMC7721肝癌细胞的端粒酶活性，并且对其有显著的促凋亡作用。结论反义端粒酶RNA能有效地抑制肝癌细胞端粒酶活性，同时显著促进癌细胞凋亡。借助抑制细胞端粒酶活性的手段来达到阻止肿瘤生长的目的，为肝癌的治疗提供了新的途径。关键词端粒酶；反义核酸；肝肿瘤；基因转染；细胞凋亡中分类号R735.7；R730.3文献标识码A文章编号1005-8664(2000)05-01-03 The effect of anitsense telomerase RN

3、A on SMMC7721ZHANG Chuan-shan WANG Wen-liang, Liu Li,et al.(Fourth Military Medical University,Xian 710033)AbstractObjectiveTo observe the effect of antisense telomerase RNA on SMMC7721 hepatocarcinoma cell line and to investigate the significance of antitelomerase therapy for treatment of primary h

4、epatocarcinoma.MethodsAntihygromycin antisense RNA eucaryotic expression vector,PBBS212/hTH,was introduced into SMMC7721 hepatocarcinoma cells by using lipofection medication.After hygromycin screening and cloning TRAP-PCR-ELISA and FCM were used to observe effects of PBBS212/hTH on telomerase activ

5、ity and cell apoptosis.ResultsTRAP-PCR-ELISA showed that experimental group registered 0.482 and control group 2.861 in telomerase activity;FCM showed that experimental group registered 13.8% in apoptosis,suggesting antisense telomerase RNA has a significant inhibition of SMMC7721 telomerase activit

6、y and a marked promotion of the cells apoptosis.ConclusionsInhibition of hepatocarcinoma telomerase activity and promotion of carcinoma cells apoptosis through antisense telomerase RNA provide an approach to the treatment of hepatocarcinoma.Key wordshepatoma telomerase;antisense oligodeoxynucleotide

7、s; apoptosis; gene transfection原发性肝癌是严重危害人类生命健康的恶性肿瘤之一，但对其具体发病机制人们依然不清楚，同时对原发性肝癌的治疗也无非常有效的治疗手段。近年的研究表明，端粒酶的活化是恶性肿瘤细胞无限增殖的重要分子基础1-3。端粒酶是一种由RNA与蛋白质组成的核糖核蛋白，其RNA中含有合成端粒DNA的模板序列。端粒酶以自身RNA为模板，在线性染色体末端合成端粒重复序列。端粒酶在大约90%的恶性肿瘤中表达，而在绝大多数正常细胞中却检测不到端粒酶活性。采用抑制端粒酶活性的手段达到抑制肿瘤生长的目的成为肿瘤治疗的新策略。为探讨抗端粒酶治疗在原发性肝癌治疗中的意义，

8、我们采用脂质体介导的方式将潮霉素抗性的反义端粒酶RNA真核表达载体PBBS212/hTR转入SMMC7721肝癌细胞中，采用TRAP-PCR-ELISA及FCM、电镜观察其对细胞端粒酶活性和细胞凋亡的影响。以期为原发性肝癌基因治疗提供新的实验依据。材料和方法一、材料大肠杆菌JM109由本校生化教研室惠赠，pBBS212-hTPR质粒由美国Geron Corporation,Villeponteau博士惠赠，该质粒由一个200bp含端粒酶RNA模板序列的TRC3反义基因片段插入至PBBS212载体的EcoRI酶切位点而构建,在mpsv启动子控制下表达反义hTR4，潮霉素(hygromycin)为

9、Sigma产品。TRAP-PCR-ELISA试剂盒购自Boehringer Mannheim公司。核酸内切酶购自Promega，脂质体转染试剂盒购自GIBICO、SMMC7721细胞由本室保存培养。二、方法(一)pBBS212-hTR质粒转染SMMC7721细胞：1.pBBS212-hTR质粒的扩增提取：按常规方法进行，将pBBS212-hTR质粒转化JM109大肠杆菌，扩增提取质粒，经核酸内切酶EcoRI酶切后，电泳鉴定质粒片段大小正确。2.pBBS212-hTR质粒转染SMMC7721细胞把处于对数生长期的SMMC7721细胞分为三组：对照组SMMC7721细胞、空载体组SMMC7721/

10、pBBS212细胞、实验组SMMC7721/pBBS212-hTR细胞，转染方法按脂质体转染试剂盒说明书操作步骤进行，培养48hrs后传代加入含HyR 350ug/ml的培养液筛选抗性细胞。继续培养两周后，可见细胞克隆形成。(二)细胞周期分析收集不同处理的SMMC7721细胞，750mol/L酒精溶液固定，检测前离心去酒精，加入250ugm/ml PI(碘化丙锭)0.2ml暗处放置30min上机检测。测定细胞周期，观察是否存在细胞凋亡。(三)透射电镜观察细胞经0.01M pH7.4 PBS洗涤两次，用3%戊二醛固定，锇酸后固定，脱水，包埋，超薄切片，醋酸双氧铀和柠檬酸铅染色，电镜下观察不同处理

11、的细胞是否发生凋亡并照相纪录。(四)TRAP-PCR-ELISA检测端粒酶活性Telomerase-PCR-ELISA.AP试剂盒购自Boehringer Mannheim公司，细胞端粒酶活性检测按照Telomerase-PCR-ELISA.AP试剂盒说明书进行。并设立阳性及阴性对照实验。在DYNATECH MR400仪器上检测450nm/630nm处标本的吸光度(A)值。结果一、细胞周期分析结果转染反义端粒酶RNA的SMMC7721细胞生长缓慢，贴壁性能差，易于消化，且早期有较多的细胞脱离瓶壁飘浮死亡，而在同样培养条件下的对照组细胞生长良好。收集转染反义端粒酶RNA基因稳定表达后的第4代细胞

12、作FCM检测，结果显示在G1期前有一亚二倍体的凋亡峰存在，凋亡细胞占全部细胞的13.8%(1)。对照组细胞则未见有凋亡峰出现，细胞周期结果分布列于附表。附表转染反义端粒酶RNA SMMC7721细胞周期分布G1(%)G2(%)S(%)对照组48.716.334.9实验组64.14.231.7二、透射电镜观察结果转染反义端粒酶RNA的SMMC7721细胞体积缩小，可见典型的细胞凋亡特征：核膜完整，染色质凝集并边集于核膜，细胞器如内质网、线粒体等结构完整，未见破坏，胞质内可见有空泡形成，表现出典型的凋亡细胞的形态(见2)。对照组细胞的超微结构基本正常，未见有细胞凋亡发生。三、TRAP-PCR-EL

13、ISA结果TRAP-PCE-ELISA法的结果显示SMMC7721细胞表达高水平的端粒酶活性，吸光度(A50A630)值为2.861，而转染反义端粒酶RNA的SMMC7721细胞端粒酶活性表达显著下降，吸光度(A450A630)值为0.482。说明转染反义端粒酶RNA对SMMC7721细胞端粒酶活性有明显的抑制作用。 讨论端粒酶在大约90%的恶性肿瘤中表达，而在绝大多数正常细胞中却检测不到端粒酶活性，因此端粒酶的活性被认为与肿瘤的发生密切相关1-3，故采用抑制端粒酶活性的手段达到抑制肿瘤生长的目的已成为肿瘤治疗的新策略，反义技术作为“基因封条”能够特异性封闭或译制其靶基因的表达。文献报道4-5

14、，利用与端粒DNA重复序列等同的6mer寡聚核苷酸可以抑制体外及动物体内Burkitls淋巴瘤细胞端粒酶活性，从而发挥抗肿瘤作用，应用反义端粒酶RNA封闭Hela细胞的端粒酶活性，可导致细胞死亡。由于反义RNA可以从复制、转录及翻译水平发挥作用，在转染后可形成稳定克隆细胞系，非常有利于特定基因的研究，因而它在基因调控及基因治疗的研究中倍受重视。为此我们采用反义核酸来封闭SMMC721细胞端粒酶活性，以期探讨抗端粒酶治疗在原发性肝癌中的治疗意义。实验结果表明，转染反义端粒酶RNA的SMMC7721细胞端粒酶活性表达显著下降，吸光度(A450A630)值仅为0.482，SMMC7721表达高水平的

15、端粒酶活性，吸光度(A450A630)值为2.861；同时转染反义端粒酶RNA的SMMC7721细胞生长缓慢，贴壁性能差，易于消化，且早期有较多的细胞脱离瓶壁飘浮死亡，FCM检测发现细胞发生显著凋亡(13.8%)，同期电镜观察也发现细胞呈显著凋亡形态。我们的研究证明：反义端粒酶RNA能有效抑制肝癌细胞的端粒酶活性，同时诱导癌细胞发生凋亡，与文献报道结果一致。我们还对转染反义端粒酶RNA的SMMC7721细胞进行了细胞周期分析，实验结果表明与对照组相比：G1期细胞数量增多，G2、S期细胞数量减少。有文献报道6细胞端粒酶活性与细胞周期调控有关，抑制细胞端粒酶活性可引起细胞周期蛋白激酶抑制因子的表达

16、改变。细胞端粒酶活性主要表达在S期。这提示我们由于在S期细胞端粒酶活性受到抑制，致使细胞在G1/S期转换受阻，影响细胞从G1期过渡到S期，并有可能延长细胞周期。这也提示我们反义端粒酶在有效抑制肝癌细胞端粒酶活性同时，也有可能对细胞周期发生影响，使细胞周期调控基因表达发生改变，进而对肿瘤细胞的增殖、凋亡发挥影响作用。总之，利用反义端粒酶抑制肝癌细胞端粒酶活性可以诱发细胞发生显著凋亡，并有可能影响细胞周期调控。本实验研究在肝癌基因治疗方面进行了有益的探讨。作者简介：张传山(1966-)，男，天津市人，博士，讲师。从事免疫病理与分子病理专业。张传山（第四军医大学病理教研室陕西西安 710032）王文

17、亮（第四军医大学病理教研室陕西西安 710032）刘利（西京医院血液科）胡沛臻（第四军医大学病理教研室陕西西安 710032）张衍国（西京医院血液科）马福成（第四军医大学病理教研室陕西西安 710032）参考文献1Haber DA.Telomerase,cancer and immortalityJ.New England J Med,1995;332(14):955-957.2Counter CM.Avillon AA,LeFeuvre CE,et al.Telomere shortening associated with chromosome instability is arreste

18、d in immortal cells which express telomerase activityJ.EMBO J 1992;11:1921-1929.3Shay JW,Werbin H,Wright WE.Telomere shortening may contribute to aging and cancerJ.Mol Cell Differ,1994;2:1-21.4Feng J,Funk WD,Wang SS,et al.The RNA component of human telomeraseJ.Science,1995;268:1236-1241.5Mata JE,Joshi SS,Palen B,et al.A hexameric phosphorothioate oligonucleotide telomerase inhibi