基因启动子分析

1、基因启动子分析一：克隆目的基因基本启动子序列我们都知道，基因的基本启动子一般是在基因转录起始位点上游，当一个基因在没 有确定其转录起始位点的时候，我们假定NCB止提交的序列就是他的完整转录本， 那么他的第一个碱基就是他的转录起始位点。而基因的基本启动子一般就是在转录起始位点的上游2000b左右和下游200b|左右，当然,这个是一般情况,具体问题还 要具体分析.尤其现在发现一般的基因都是有几个转录起始位点的 我们通过该基因mRN序列和基因组序列BLAST就能够在染色体上找到这段基因组 序列。我这里用huma的AGGFS因做个例子给大家具体演示一下.1首先需要在NCB里面查找到AGGFS因的mRN

2、序列，这个我想大家都应该很清楚, 如下图.Lri/qsr. eyi: c d itq" rrVG 3QTr/g皀二皀_£苧1：口：'3“它左益二匚-" / ff e * &G=rrc H 7 “-e = z - ty.= " z Z 2 2 i ： n /cene my二:二二J三 qW L rr / ge 口c 口 yra= TrU5 = 137Lrpg且g'ctcttcx ggcctctggt611211B124130136121481541 gaaacfcaaca601 ggqag且h臣匸廿661 tggtcaatcl;72

3、1 号匸 gHUtg 比 he: 7B1 gaccattuac811 tatagacaq901 gagataact961 gccqtatcac 1021 accggtccec 1091 tactatrtg 1141 tatccgactt 1201 ccagattctt 1261 agtgxtgaac 1321 aaataggca 13S1 aetatzag&gtagctaaggcg gaaggtggag gggagarcga gaagctgrtgtagtuatgar tgaaaatca且tggTcgTtatacraaagtaaatgaggaaaag caatgaggaaaaatagtc

4、cc tga&aacatccttatccgac rccgrtcgc cgagcccg agccgggtgl: CQtCCIjtttC acggcctcgg gagctggacc cggcaggcgc gctcctccct aggccgcgca ttcggcracH gaggctgcct ggccrtgaacg aggcgccgtcaccaggagct aagata且匸且h u曰gpt匸且ttt tgtzcag 且 tua aagtagaaaa tggaccattv ccttagaagg iigactgqart attatg且匸tu atgtgg且a旦口 ctagcacaaa ctgca

5、acaaa atacaagctg ttcatcAcaa crcctcttca ctgtctctgt caccgggeag agtgagt匸tu ttogctgacc cagcccctcc accgccgcg?ccgcacgeag aaagtctgat ZaZcagacg aca agate: aa tgargett ac tgcGLcaaat ctcAcatta agetggagaa ggq-ccatccr agg-getcar gcgcgatcca gegtjegaega tcg'ccgccgc aag-ttggaac cat cac acaq gtQaaq&ac gtaga

6、agtac tauthu吕日匸口 get at:cgaad cct ggt accg tcacaggagc getgaaagtt gaa.aat actq ctetattatg cag'tttcatt gat aaa aaar gatttaacx gaaaatttcq cccaaagtcA teta&rtcaa ggtagtttcc cggteeccrt ggee 且 ggggc: gtggtctctg gcacj 七 ctcgc ctjcccacctc gtgaactgcg aaeggetgra tcagtaaaat aaacagagaa aegttagtet cttctat

7、ttt atagaacaga GagGatctQG tgagagctgc gactgtatrt atcctcccac ctcgagtaga tzgaagaagaa cagaggatca caaatatgaa ctgttccaac catcatttaaaggaaagttr gcccgttgcc caacgcggcc ggtccgccgg (jeegga get； c ccccgagcct ga?ctgcaag cc&gaacgca actccaacgc ecatgctcct ccaaaraaa gaattetaaa aaatgttaaa. atuacaaca. ageagaageg tg

8、accacagc eggaat teat tttgcaacct aagaaa a.gat aaaageette aaagaaggee tatggaaau agatg&ga&a2然后就是用这段mRN序列和人类的基因组序列BLASTBLAST Assembled GenomesChoose a species genome to search, “list all qenomic: BLAST UdtehESESi° hhimHn° Rat口 Zl jaBFMogZs tha阳 ns口 0爭阳囱掉啊 Egg 恰甘口 Dneio 用Ho DrosoZ伽播它翠st赴

9、f3 BLAST!到了很多结果，我们往往选择最上面那个最匹配的结果v DescriptionsSeqtierLees produjcing signiflcane aligmients!il.N.Tii_pu£2 .匸_.!£ LH.s5_£07.a 甘心论 sapiens eKrretues&me 5 genemit t.- it已十 i 川叫丄|3任衣95丄-1 Hm£iAJGaj44 M 6Acimcj m皑pij色n吕巴hrdatomM皀月？色.- 疋色唱 I1 IHmCr aAADElZl_224 H&Wia sapiens c

10、hrahiGSontie 5.工已 f MT_口丁25，丄3 I He 1. U_1了951 Hctno sapiens chr omosaiine ID genomi. i:mf I NV厂92宓4.1 |HmCaADEu7_44 Homo sapiens chramosome 12 ge._ 工已f I NM”_00IE 41J.ME - 1 IHsUn_W盟MM 13£ Homo sapiens genomic conti.BapiEiis chronio30lne 4 geiiaatiic . Homo sapiens chrom口口口!亡 3 ge.sapiens chro

11、niogcme 3 genoati:Lc Homo 辭I 丽DU 14127?.丄专6耳匸f I NV厂口0边肛竹7： 1心白盯阳人阳山二皀f LTT,D2292，1了1 H$4 2 2©4合 Homo工亡f I 盼匚口01*3£!878 -16工亡fI MT。?理59 14 I盲HomoI 时应 口 511丨日日吕1J 6piena chromosonis 3 gun* * EtQing sapXens genomic; *耳口ipo sapXens 融un口口outXi * Hamoref丽 933173.1HsC匚aAHpB匸 3 64 Homo sapi.en3 c

12、hramosame 6 cren,-refNT 02477.11 Hsl 6 2929 Homo sapiens chraniosome 16 qewnd. -工巴f I NW jjg：L8 38 28电阳丸 1(358chrcnnoscnie 16 ,-Hom sapiens chrcmQsonie 1 genomic u* Homo apxetis chrmcsanne 1 牙已门* Hoibo sapiens g hr emo some 1 ge no h “f I 丽工22口33 +1 I 曰sS aAADBCiE二 16L3 Homo sapiens genoini.c ccnt&#

13、177;g? ” .工讥丨MT_CJ329了九日I吊1_盟133工建fl価口CJ18_3857g* 2 I豆导1_诟人3工_3E 工言£| 丽号2 13jl +1 |日吕CraADBClE4点击之后就可以看到下图，这个基因的14个外显子和13个内含子在5号染色体上 的位置一目了然，第一个外显子在上面，说明这个基因在染色体上是正向的，基本 启动子就应该在第一外显子上面，我用红色的方框标明了。FTPDsbAs lacie view 時M 氏 Opt MillsCorr prees Map M ftecp on Shhnwn.三一gF一5E- F K 1 1 qf II召 r«&

14、gt;i+T L L±4a 2 Avofl-O tn- flqq 9 r- 1 fl 1 M ?;££ w盟 Lv?1IBLithtI<tiiuty-W I 573Elast Etkleiiht尸蛍3囑 56S. tEUBlast hitTndt7=10r,% fi?1 FT?BhEthitI妇血y 】Q0% E75. 1012Blast Litkleiiht尸：0两 IU42 1231Blast hitM=n 陀L购轴 1229 1565Blast hitLJenhty= 10 0R4i15601673Bkst hitI<knai7=10C%1217

15、25El如hi【l<leiiaty00%17221827Blast hitl-_lenht7= ) 0 Cfi4i1E261的HEhst hi：陆ndg?涌19fl7亦BLschiI<lcnaty=9920712204Blast hitl-_lenhty= ) 023D4Blast hitI灰nd旷北口心2304侮5大家有没有注意到左上方有个数据框，我把数值改为76,360K到76,362.200 , 刚好2200BP包括了第一个外显子的前200B左右.然后点击红色框标明的Dow nload/view seque nee.K 的 ion siown:fa g 或 k tJen毡尸

16、100% L.573Siimmairy of Maps ;Map I; Abehq 'febTabR VkwDisplayed- 76|360K'76,362p200 bjj DownloadN/iew Sumicnc e/E駅, eTxa mo拒七 CM Chromxotne; 351? 7 aOI-mtwiris Labeled: 2 Total models in Region 2、血p 2: KefSeq Tramcwtc 'On SeqjenDe血企页级T.flki IDisf.7K餐(1広：&鮎7?7fin hp Tx讪TVif 如卄-1 - d T

17、oiad RrfS eq enpts On Chromo£om«: 1455 f3 notl0：ak:edTrarwctipfe Labeled: 1 Tot 就 B.ef5eq Trsn senpts 曲 Reon: 16然后就到了这个界面,Sequenee Format选择GenBank,然后点击Display.就 得到我们所需要的序列了.ihunian.i (Build 36.3)Chrcmio sotnt.:idhist b-/：from 763S0000OKStrand, plusto: G362200adjust bvj40KChange R&gion&

18、#39;'Str-andRecoil to retriex'e "in chromo some coordinates'):Fomiat G&nBank_ *This chromosome region corresponds to the contig region(s):Conristart stop strandXT_ijij6-1 3.1- 2691 >602 26i?2'j£Ci2- Eigplay1 Sav亡 to Disk I'iew Evidence IadeIXIaker7这里我们可以看到1989到22

19、01是AGGF的mRN序列,说明我们的确找到了该基因 5'非翻译区的上游启动子序列.建议将这2200bpS克隆下来，上乞二亡=”蛊匚兰三二”丿匚段百unit: factor wlh G pacch and FH demais/excepticnnUD31as3LfieddisGrEpaEGy"/n3e= rrDerved by auu=r:aed =u:rjp'匸&二二nn也二 analysu gene predretror met?:ad: BestRefseq. 5'jppcrzisc evidence 虫二ir二丄总上二uy ro i 1 riJ

20、mTL11.nranscript_id=Z _EC6. £rhf业_乂二士h書三:4总亍虽莎厂55L：'9r,/ dtK ref="?Z 3NC:空”/dbx石百r,CRZGIUascatrca-£61121181tectaaraacacGGc©匸匸二匚二吉匸注注 gaccctract Ci二艮匚己二匸己二utyccagagca301361421481=:-ccadcca&netc匸匸DUN己己acaaaacacazgzczctctt;(jnr；nr；ftT,mcacxtgagg aas.aa.acstag ctcxtgttca eecr

21、cacacagaa_ccccdcd aaai/Laa&tcc匸匸比乙匸t匸UCD匸二匸匕注螢二匚EG cauBacacca 阴匸 QgggG ggttatccccuxggt匚匚昌ea-atsrsLa 匸匚Eg二t二己己a. acaaaccac aacagggatg总匸ccrGcaatat,. atgciLgciCtG atggxcaggggcatttacgg c&"cracac&a*t =ta.i3i*era二己匕匸iggc己己己ctcctt-ttgcccatccacr t eq匚匸grerge agaccccaga ggccaccqat aactcctct

22、ccactc&oetert-geaaacgactcagacrsr.fli a以上的步骤就是基因基本启动子的查找,其实还有很多调控序列是在基因内含子区 域或者是基因的3'非翻译区等,序列查找的步骤和上面是一样的.8还有一个方法更加简单,那就是用AGGF的前60bp序列和nucleotide数据库 BLAST,以得到该序列在染色体上的位置,需要注意的是,如果是反向的序列的话, 我们就要选择反向互补的序列Basic BLASTChoose a BLAST program to runnucleotide blast Search a nucleotideusing a nucleod

23、de query| Algonthms: blastn. nnegab-last. disccntiguous megabla&trotejn h|ast Search protein database using a protein quoryAlgonthms: blsstp psi-blasl, phi-blastiPubMedMudHlidcProteiniGerwmeSearchNucleotideVforGo丄与页Display| GenBankvShov5v Send to7 Hide- sequence 口allbui aene. CD's and iniR2&

24、lt;/Range: fivm 16 370 649to|26 570 543ShoiY -.vhole sequence| Rt'Fers# contplfDienifd s二：软件预测顺式作用元件，做点突变分析得到这些序列后,克隆进没有启动子载体pGL或者pTAL-luc中去，转染细胞，测定 荧光活性，如果有很强的活性,那么说明你已经成功克隆到了该基因的基本启动子. 然后可以通过5 '非翻译区一系列的缺失突变，不断把范围缩小,找到哪一段序列对 于该基因的启动子活性是必须的或者是最重要的。当找到这个比较核心的启动子序列后，可以通过一些在线的软件去预测其顺式作用 元件的位点,每

25、个在线软件都有自己独特的算法分析,得到的结果并不都是可靠的， 每个软件都有自己的优势，需要多综合一些软件预测的结果,并通过分析预测出来 的转录因子是不是和该基因有功能上的联系等做进一步的选择，继续做下面的验证实验。下面这两个有商业化的软件：http:/www.ge no matix.de/http:/www.ge ne-regulatio nsfac下面这两个是免费：http:/www.cbrc.jp/research/db/TFSEARCH.htmlhttp:/www.cbil.upe nn. edu/cgi-b in /tess/tess用TES举个列，直接在首页下面的方框里输入你要分析的

26、序列就可以了Try a qukk torch with the d»f«ult oaramtttrfJntj T1U*：.-2z jvbich <-Search DNA for BindingITSS also lees you search rirough your own sequence for TFBS You caniMlud总 ycur owfl at CDfisefKiE anrtgs diKi'oi weight m&ti ccs in Uw 轮uuh lLu Im Combined S««rch iiridw &#

27、39;Site S恫diw' iz ihf nbow w u-f? iif nHf r I叭 cm；如沏cnESS assigns a FESS job - umbeT t al seqw&nce search job石 The fib results are stored oft cur 昭 wr for s per od M jiix? spccficd in ihe scajcli subml him. Durr>g ill匕 time tfOu tnsh 搐附us ng mg 101m on this pH>TESS can also email r&siAs iq you as a t-nelmiied file 5Lii;ab m fc' loa山 ng ntc a spreadsheet projrim同样在首页，通过下面的方框，你可以查找一些转录因子的相关信息.Query for Transcription Factor InfoTESS also has data browsing and querying CBpabih