一种人FLT3配基同源异型蛋白在组织中的分布

1、    一种人FLT3配基同源异型蛋白在组织中的分布        【摘要】目的研究人FLT3配基膜外区缺失139bp的同源异型蛋白在组织中的分布特点。方法采用聚合酶链或逆转录-聚合酶链反应法对FLT3配基在人肝脏、脑、骨髓、肌肉、肾脏、正常人外周血及4种白血病细胞系中的分布进行了研究，并利用DNA测序法鉴定PCR产物。结果除脑中未见FLT3配基表达外，在肝脏、肌肉、骨髓、肾脏、胎肝、正常人外周血细胞及白血病细胞系中均可检测到FLT3配基，而膜外区缺失139bp的FLT3配基

2、同源异型蛋白只分布于骨髓 、胎肝中。结论FLT3配基膜外区缺失139bp的同源异型蛋白分布于造血组织中，可能与造血调控有关。【关键词】配基，FLT3造血细胞生长因子聚合酶链反应Localization of a FLT3 ligand isoform in human tissuesLI Huiliang, CAI Yinglin, XU jing， et al. State Key Laboratory of Experimental Hematology, Institute of Hematology, CAMS and PUMC, Tianjin300020【Abstract】Obje

3、ctiveTo explore the localization of a human FLT3 ligand isoform deleted 139bp of extracellular region. MethodsLocalization of the FLT3 ligand isoform in human tissues was studied by using PCR and RT-PCR. The PCR products were identified by DNA sequencing. ResultsFLT3 ligand was expressed in liver, f

4、etal liver , bone marrow, muscle, kidney and peripheral blood cells and in four leukemia cell lines, but not in brain, while the FLT3 ligand isoform only in fetal liver and bone marrow. ConclusionThe FLT3 ligand isoform was expressed in hematopoietic cells and might be involved in hematopoiesis regu

5、lation.【Key words】Ligand,FLT3Hematopoietic growth factorPolymerase chain reactionFLT3配基（fms like tyrosine 3 ligand）是继干细胞因子(SCF)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)后的又一种膜结合型早期造血生长因子1。它以多种 同源异型蛋白形式存在2。目前对它的研究主要集中于可溶型和膜结合型FLT3配基，发现其广泛分布于造血基质细胞以及肾、肝、胎盘等组织中，具有很强的协同刺激造血干祖细胞增殖分化的能力， 在干祖细胞的自我更新及T细胞、B细胞、树突状细胞、红细胞的发育过程中起着重要的调节

6、作用3。而对FLT3配基的其它同源异型蛋白的分布、形成、结构及其功能的研究却未见报道。我们用聚合酶链反应(PCR)和逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)从人不同组织cDNA文库和4种白血病细胞系及正常人外周血细胞中扩增FLT3 配基膜外区，研究其膜外区缺失139bp的同源异型蛋白分布特点，推测它可能具有的功能。材料和方法1细胞和细胞系正常人外周血细胞取自健康男性献血员，采用低渗溶血法分离白细胞。人白血病细胞系 HEL、K562、MO7e、DAMI 均为本室保存传代的细胞系。2DNA文库人胎儿肝脏文库ZAP由本室构建，人骨髓、肌肉、肝、肾、脑文库DNA由本所构建，本室保存。3引物引物根据膜结合型

7、FLT3配基膜外区5、3序列设计，使用ABI 381A DNA合成仪合成，OPC柱纯化。上游引物为：5-CGGAATTCATATGACCCAGGACTGCTCCTTC-3，5端含EcoR切点，下游引物为5-CGGGATCCTCACGGGGCTGTCGG-GGCTGT-3，5端含BamH切点。4PCR/RT-PCR正常人外周血细胞和4种白血病细胞系总RNA的提取按异硫氰酸胍一步法4进行，以所提取总RNA为模板，逆转录合成cDNA第一条链。逆转录反应条件：100ng随机引物，4×dNTP各10nmol，5×缓冲液 8l， RNasin 40U，200U M-MLV 逆转录酶，用

8、去离子水补足体积至40l，置于37温育1小时。以逆转录产物和文库DNA为模板，利用5、3引物分别扩增基因片段。PCR条件为：94变性45秒，64退火30秒，72延伸45秒，35次循环。5PCR产物的鉴定将PCR产物进行低熔点琼脂糖凝胶电泳，切下目标带，回收DNA。将回收DNA用EcoR、BamH酶切后装入用相应酶切的测序载体M13mp19，提取单链， 按ABI公司荧光测序试剂盒说明操作，在ABI测序仪上测序。结果1FLT3配基在组织细胞中的分布用胎肝文库、肾脏、肝脏、骨髓、脑、肌肉cDNA文库以及逆转录得到的5种细胞cDNA为模板，PCR扩增得到的基因片段按大小分别为330bp， 470bp，

9、 560bp三种(1)。其中骨髓文库cDNA以及胎肝文库cDNA扩增结果有3条DNA片段，而肾脏、肝脏、肌肉、正常人外周血细胞以及4种白血病细胞系有2条DNA片段，脑文库中未扩增出DNA。说明FLT3配基广泛分布于除脑外的组织中，这与国外文献报道一致5，而膜外区缺失139bp的同源异型蛋白只分布于骨髓及胎肝中。2PCR产物的鉴定结果 回收300bp的PCR扩增片段，构建测序载体M13mp19-300（2）。利用ABI370序列分析仪得到329bp的插入片段，经分析所克隆基因为第5，6外显子（共139bp）缺失后产物的膜外区序列（3）。    2测序载体M

10、13mp19-FL300示意讨论由于高等真核细胞中来自一个基因的RNA 前体分子中一般不止1个内含子，因此某个内含子 5供点又可以在特定条件下与另一个内含子的3受点进行剪接，从而切除这二个内含子及其中间的全部内含子或外显子，即mRNA的选择性剪接。来自一个基因的mRNA前体因选择性剪接而产生多种mRNA，翻译出不同的蛋白质，或形成一组相似的蛋白质家族，即所谓的同源异型蛋白。同源异型蛋白可以在不同发育阶段、不同组织或在细胞内不同亚细胞结构中出现并发挥其功能。目前认为哺乳动物细胞中大约有5%的基因能以这种方式进行剪接，各个同源异型蛋白既具有相同的结构域又有各自的特点6。FLT3配基全基因有8个外显

11、子，由于其转录mRNA的选择性剪接，形成不同的同源异型蛋白：由所有外显子拼接形成的mRNA，翻译时终止M: 分子量标准(100bp ladder)；1：胎肝文库；2：肾脏；3：骨髓；4：脑；5：肝脏6：肌肉；7：K562细胞；8：HEL细胞；9：MO7e细胞；10：DAMI细胞；11：外周血1FLT3基因PCR扩增结果    3膜外区缺失139bp的人FLT3配基序列于第6外显子，形成一个可溶型蛋白（sFL)；由于第6外显子的缺失，发生移码突变，形成一个穿膜型蛋白（mFL）；由于第5，6外显子的缺失，形成另外一种穿膜蛋白。目前的研究主要针对FLT3配基的

12、前两种形式，对第3种同源异型蛋白的研究国内外还未见报道，而作为一种正常表达的穿膜蛋白，它一定具有独特的生物活性。我们根据穿膜型FLT3配基的膜外区5、3序列设计了一对引物，用PCR方法检测FLT3配基的3种同源异型蛋白在不同组织中的分布。研究结果显示除脑中未见FLT3配基表达外，在肝脏、肌肉、骨髓、肾脏、胎肝、正常人外周血细胞及白血病细胞系中均可检测到FLT3配基，而除骨髓、胎肝有3种同源异型蛋白外，其余的均只有两种同源异型蛋白，即可溶型同源异型蛋白和穿膜型同源异型蛋白。根据血细胞形成的理论，胎儿肝脏和骨髓在发育过程的不同阶段分别发挥着造血中心的作用，而第3种同源异型蛋白只分布于这两种组织中，

13、因此它可能与造血调控有密切联系，对其功能的研究应当具有重要的意义。作者单位：天津，中国医学科院，中国协和医院大学血液研究所，实验血液学国家重点实验室参考文献1 Lyman SD， James L， Johnson L，et al. Cloning of the human homologue of the murine flt3 ligand: a growth factor for early hematopoietic progenitor cells. Blood， 1994，83:2795-2801.2Lyman SD， James L， Escobar SS, et al. Iden

14、tification of a soluble and membrane bound isoforms of the murine flt3 ligand generated by alternative splicing of mRNAs. Oncogene， 1995， 10:149-159.3Lyman SD， Jacobsen SE. c-kit ligand and FLT3 ligand: stem/progenitor cell factors with overlapping yet distinct activities. Blood， 1998， 91: 1101-11344Chomczynski P, Saccki N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform ext