中药复方962胶囊对老年大鼠海马区神经生长因子及其受体表达的影响

1、    中药复方962胶囊对老年大鼠海马区神经生长因子及其受体表达的影响            作者： 张 兰李 林时间：2007-11-23 10:28:00                     摘  要  目的：

2、在老年性痴呆的发病中，年龄是最主要的危险因素，随年龄增长，发病率显著增高，自然衰老大鼠模型是比较接近老年性痴呆病理改变的动物模型。我们以往的实验证明：中药复方962胶囊(含何首乌、石葛蒲等六味中药)能显著改善老年大鼠学习记忆功能。本研究观察中药复方962胶囊对自然衰老大鼠模型海马CAICA4区神经生长因子(NGF)及其受体TrK A表达的影响，探讨中药复方962胶囊治疗改善学习记忆功能的作用机理。方法：雌性Wistar大鼠老年为22月龄，青年为5月龄。阳性对照药为脑复康(piracetam)0.56g/kg，中药复方962胶套高剂量1.8gkg，962胶囊低剂量0.9gkg，每日灌胃给药一次，

3、连续灌胃2个月，进行学习记忆实验(水迷宫)和旷场分析后，每组随机选取5只，灌注固定，冰冻切片，片厚40m，每份标本均ABC法行NGF和TrK A免疫组化染色。采用法国Noesis Vision公司VISILOG5.0图象分析系统对组织切片进行分析。显微镜放大倍数为10×10，在海马CAl区锥体细胞层连续摄取3个视野，这三个视野包括了整个CAl区，记数3个视野内总阳性细胞数量、 阳性细胞总面积(象素单位)及阳性细胞灰度积分值(灰度单位)。海马CA2区连续摄取2个视野，海马CA3区连续摄取2个视野，海马CA4区摄取齿状回包含的1个视野，包括了整个CA2、CA3、CA4区。数据用均数

4、77;标准差表示(M±SD)，结果采用t检验。结果：老年大鼠海马CAl、CA2、CA3、CA4区NGF表达较青年对照明显减少，阳性细胞数量为青年对照的19.89，11.46，6.65和26.32；阳性细胞总面积为青年对照的13.97，6.76，5.19和25.01；阳性细胞灰度积分值为青年对照的41.05，35.49，16，74和29.17。海马CAl、CA2、CA3、CA4区神经生长因子受体Trk A表达较青年对照也明显减少，阳性细胞数量为青年对照的12.42，7.07，9.26和29.33；阳性细胞总面积为青年对照的7.61，4.92，5.62和23.79；阳性细胞灰度积分值为青

5、年对照的29，30，18.70，17.51和34.19。以CA2、CA3区的减少最严重。中药复方962胶囊和脑复康均能提高老年大鼠海马CAl一CA4区NGF和Trk A阳性细胞数量、阳性细胞总面积和阳性细胞灰度积分值，962胶囊高剂量组基本恢复青年对照组水平。结论：老年大鼠神经生长因子(NGF)及其受体Trk A在海马区表达明显减少，可能与其学习记忆能力下降有关；中药复方962胶囊能够明显促进老年大鼠海马区NGF及受体TrK A表达，可能是改善其学习记忆功能的药理学基础。增强内源性神经营养物质的表达对老年性疾呆的治疗有重要意义。关键词中药老年大鼠神经生长因子TrK A受体前言 老年性疾呆(Al

6、zheimers disease。AD)是一种老年神经退行性疾病，临床以进行性记忆障碍和后天获得性知识丧失为特征，原因不明，尚元有效的治疗方法。自然衰老大鼠模型是比较接近老年性痴呆病理改变的动物模型。我们以往的实验证明：我室自行组方并研制的新复方962胶囊(含何首乌、石葛蒲等六味中药)能显著改善老年大鼠学习记忆功能。神经生长因子(nerve growth factor，NGF)在调节神经元生长和存活方面起着重要作用，AD过程中神经元的丢失至少部分是由于神经营养因子的缺乏。本文观察自然衰老大鼠脑内是否发生神经生长因子(NGF)及其受体Trk A表达的变化，以及962胶囊对内源性NGF及其受体Tr

7、k A表达的影响，探讨962胶囊改善学习记忆功能的作用机理。  材料和方法1  药品：中药复方962胶囊，委托北京第四制药厂加工提供，批号：980515，每克干粉含生药量6.25克。实验时采用水溶解，动物灌胃量10m1kg。阳性对照药品：脑复康    (piracetam)，由北京市曙光制药厂提供，批号：970618，京卫药准字(1996)第138050号。实    验时用水溶解配成0.056gm1。2  动物：Wistar大鼠雌性，老年大鼠为22月龄(体重330±32g)，青年为5月龄(体重3

8、25±19g)。购于北京医科大学动物中心，动物证号：医动字013056。3  试剂与主要仪器：ABC试剂盒、神经生长因子(NGF)兔抗鼠抗体、酪氨酸蛋白激酶受    体A(Trk A，主要为NGF的受体)兔抗鼠抗体均购自北京中山试剂公司；恒温冷冻切片机为英国山盾公司ASE620型，光学显微镜为NikonTE300型，图象分析系统为法国NoesisVision公司VISIUG5.0。4  方法：    (1)分组与给药：分组情况见表1，每日灌胃给药一次，灌胃2个月后，进行学习记忆实验(水迷宫)和旷场分析，然

9、后灌注固定，取材进行组织形态学实验。表1  大鼠分组给药情况 分组给药折合成人剂量的倍数青年对照水老年模型水脑复康脑复康(0.56gkg)7倍962胶囊低剂量962胶囊(0.9gkg)7倍962胶囊高剂量962胶囊(1.8g从g)14倍注：962胶囊成人临床用量：7.5g60kg日     (2)脑标本的免疫组化染色：每组随机选取5只，灌注固定，冰冻切片，片厚40m，为冠状切面前囱后4.4mm。PBS洗5分钟×3次，3H202室温孵育10分钟，PBS洗5分钟×3次；810封闭用羊血清孵育20分钟，吸出，加稀释好的一抗4过夜(一抗稀释度

10、：NGFl：120，TrkAl：120)；PBS洗，加生物素化的兔二抗(1：200稀释)室温放置3小时3PBS洗，加辣根过氧化物酶标记的三抗(1：250稀释)孵育2小时；PBS洗，DAB显色2分钟，镜下控制染色程度；Carriz浅复染细胞核，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。阴性对照设立；分别以洗液和非免疫的正常鼠血清代替一抗进行免疫组化染色，余步骤同前。阳性反应为组织细胞结构呈棕黄色颗粒聚集。    (3)图象分析处理：采用法国NoesisVision公司VISII。OG5.0图象分析系统对组织切片进行分析。显微镜放大倍数为10×10。在海马CA

11、l区锥体细胞层连续摄取3个视野，这三个视野包括了整个CAl区，记数3个视野内总阳性细胞数量、阳性细胞总面积(象素单位)及阳性细胞灰度积分值(灰度单位)。海马CA2区连续摄取2个视野，海马帜3区连续摄取2个视野，海马CA4区摄取齿状回包含的1个视野，包括了整个CA2、CA3、CA4区。(4)统计学处理：本研究均使用SPSS软件进行分析，数据用均数±标准差表示(M±SD)，    结果采用t检验。实验结果1  中药复方962胶囊对老年大鼠海马CAl一CA4区神经生长因子(NGF)表达的影响结果见表2。青年对照大鼠海马CAl一CA4区NGF

12、阳性神经元分布较多，老年大鼠模型组海马区NGF阳性神经元数量、阳性细胞面积及阳性细胞灰度积分值与正常青年对照组相比均显著减少；图象分析结果表明，老年大鼠阳性细胞数量在CAl一CA4区分别为青年对照的19.89，  11.46，6.65和26.32；阳性细胞总面积为青年对照的13.97，6.76，5.19和25，01阳性细胞灰度积分值为青年对照的41.05，35.49，16.74和29.17，其中老年大鼠海马CA2、CA3区NGF的表达减少最严重。962胶囊与脑复康给药组老年大鼠，海马CAl一CA4区NGF阳性神经元数量、阳性细胞面积及阳性细胞灰度积分值有不同程度的增加。962胶囊大剂

13、量组(1.8g，kg)老年大鼠海马各区的NGF阳性神经元基本恢复青年对照水平，阻性细胞数量是未用药模型组的4.5，5.1，9.7和3.4倍；阳性细胞总面积为模型组的7.6，9.8，12.5和4.0倍；阳性细胞灰度积分值为模型组的1.9，2.5，6.8，3.7倍，962胶囊对老年大鼠海马CA2、CA3区NGF的表达增加作用最明显。 表2  962胶囊对老年大鼠海马CAl一CA4区神经生长因子(NGF)表达的影响 NGF海马区青年对照老年模型脑复康962胶囊962胶囊阳性细胞数量 (056Bk8)(09Bk8)(1，8Bk8)CA11198±76.3238±12474

14、0±59.2786±47.71321±696*CA22127±110，4*244±2581341±559*1106±838*1475±64.1*CA31425±49.4*95±7.5112.O±56.4*755±76.9*l019±53.2*CA4386±22.6*102±104399±21.8*363±28.3*45.l±30.7*Total5136±2544*678±2783601±

15、1770*3009±19584266±202.2*阳性细胞总面积(×10象素单位)CA1330±222*4，6±3.4181±145252±180*396±22.4*CA2804±48.5*54±6.9486±27.9*445±37.9*581±27.1*CA3471±214*24土2233.5±208*281±34，3325±107*CA4111±86*28±3.380±4.6*134±

16、;96*140±118*T0taI1717±90.7*153±761082±61.9*1112±818*1463±59.6*阳性细胞灰度积分值(×10灰度单位)CAl354±150*145±104304±150291±15，7428±9.1*CA2474±148*168±134601±21.4*372±21.0580±178*CA3452±144*76±70613±4Q4*329±32.

17、9594±27.6*CA4262±163*76±7.8340±27.5*227±195358±32.4*Totd1541±379*465±22.31858±915*1219±847*1960±753*      n5，x±s，  与老年模型组比较，  * P005，  * P001，  * P0001， 2         中药复方962胶囊对老年大鼠海马CAlCA4