两种基于RAJI细胞的抗CD20单抗新型定量方法的比较及在药物代谢动力学中的应用

1、两种基于RAJI细胞的抗CD20单抗新型定量方法的比较及在药物代谢动力学中的应用         11-04-22 16:20:00     编辑：studa20            作者：董增祥 王清清 陈立慧 侯盛 董立厚 王诗鸿 欧伦 刘秀文 宋海峰【摘要】  建立和比较基于RAJI细胞的流式细胞法(Flow cytometry assay

2、，FCA)和细胞放射免疫法(Immunoradiametric assay，IRA)测定重组抗CD20人源化单克隆抗体(rantiCD20zumAb)的浓度。两种方法均利用标记后抗体和被检测抗体竞争性结合RAJI细胞表面的CD20抗原，由标记后抗体的荧光或放射性变化而间接反应检测抗体的浓度。FCA和IRA定量范围分别为0.1100 mg/L和0.0420 mg/L，FCA的日内及日间精密度分别小于4.0%和3.0%，准确度为-1.7%1.1%，IRA的日内及日间精密度值均小于7.0%，准确度为-8.9%13.2%。方法学确证研究表明，两种方法均具有良好的特异性、灵敏度、精密度和准确度。血浆样品

3、分析结果显示，两种方法具有良好的一致性，是检测猕猴血浆中人源化单克隆抗体浓度的理想方法。 【关键词】  重组抗CD20人源化单克隆抗体， 流式细胞法， 放射免疫法， 药物代谢             1 引 言CD20抗原(人B淋巴细胞限制性分化抗原)是一种疏水性跨膜蛋白，分子量约为35 kDa，表达于前B细胞和成熟B细胞上，在90%以上的非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)的B细胞上也有表达1,2。但是在造血干细胞、原B细胞、正常浆细胞或其它正常组织未发现表达。CD20抗原

4、不从细胞表面脱落，且与抗体结合后不发生内化，循环中未发现游离CD20抗原，CD20可作为靶位点与抗体结合用于治疗肿瘤35。重组抗CD20人源化单克隆抗体(rhantiCD20zumab，RACD20)是一个靶向CD20抗原，由人鼠嵌合抗体人源化改造而来，与抗CD20嵌合抗体美罗华(RituximAb)相似，通过多种机制产生杀伤肿瘤细胞作用。其一是直接作用，包括补体依赖的细胞毒作用(CDC)和抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用(ADCC);其二是间接作用，包括促进细胞结构改变、诱导调亡和提高细胞对细胞毒性药物的敏感性等68。该抗原主要适用于非霍奇金氏淋巴瘤。RACD20有效作用的发挥依赖于它能够到达

5、肿瘤细胞的多少，因此准确测定静脉滴注RACD20后病人血中的药物浓度，对于制订合理的给药方案具有一定的指导意义。目前，测定RACD20的方法很少，主要针对RituximAb采用的是酶联免疫吸附测定法(ELISA)911，但是由于没有商品化的试剂盒，在采用ELISA时需要合成较多试剂，操作过程复杂、费时、费力。基于细胞表面抗原来定量检测生物基质中的抗体具有一定的优势：可以针对抗体药物选择含有特定抗原的细胞从而提高特异性;可以在定量分析的同时进行定性的机制分析，而且分析过程操做简单、快速、准确。本研究采用细胞表面表达大量CD20抗原的RAJI细胞12，建立了基于RAJI细胞的RACD20的流式细胞

6、法和放射免疫法，利用标记后RACD20和被检测RACD20竞争性结合RAJI细胞表面的CD20抗原，由标记后抗体的荧光或放射性变化而间接反应被检测抗体的浓度。分别进行了两种方法的方法学确证，并比较了两种方法在方法学及测定猕猴血浆样品上的优缺点。2 实验部分2.1 仪器与试剂流式细胞仪(美国Becton Dickinson公司);Wallac1470 计数仪(美国PerkinElmerTM公司);HP1100四元泵液相系统(美国Agilent公司);RadiomaticTM 525TR型流式液闪仪(美国Packard公司);Heraeus培养箱(上海贺利氏公司);超纯水系统(美国MILLIPOR

7、E公司);TLLC高速台式离心机(北京四环仪器厂);微量振荡器(国华电器有限公司);微量加样器(美国Gilson公司)。RACD20(纯度> 98.0%，上海中信国健药业有限公司);异硫氰酸荧光素(FITC，上海中信国健药业有限公司);Na125I (PerkinElmerTM公司)，放化纯度为99.0%，放射核素纯度为99.9%，比放射活度为643.8 GBq/mg Iodide;Iodogen试剂，即1,3,4,6四氯3,6二苯基脲(美国Sigma公司);125I标记的RACD20(纯度> 98.0%，自制);RAJI细胞(上海中信国健药业有限公司)。实验用水为二次蒸馏水。猕猴

8、血浆样品的采集：每组健康雌性猕猴2只，健康雄性猕猴1只，RACD20 10 mg/kg于0.5 h内在猕猴后肢外侧静脉滴注完毕，于给药前和给药药后30 min，1，2，4，8，12，24，36 h，2，3，4，5，6，7，8，9，10 d在注射对侧后肢静脉取血0.8 mL于EDTA抗凝管中，离心分离得血浆，样品于-80 保存待测。2.2 实验步骤2.2.1 FITCRACD20的制备和纯化 以25 mol/L碳酸盐缓冲液(pH 9.0)将欲标记抗体稀释成1.0%浓度，装入透析袋中。用上述缓冲液将配制0.1 g/L FITC溶液，将透析袋浸没于10倍抗体溶液体积的FITC液中，在4 电磁搅拌下透

9、析标记24 h。取出透析袋中标记液，用Sephadex G50凝胶纯化去除游离荧光素，分装后贮存于4 冰箱中待用。2.2.2 125IRACD20的制备和纯化 采用Iodogen法标记RACD20。称取1 mg Iodogen试剂溶于0.5 mL氯仿中，取50 L加至试管底部，用氮气吹干，加入2 mL RACD20 20 mg，加入51 MBq Na125I，室温振荡反应12 min。将上述标记混合物加在50 cm×1 cm的Sephacryl S200 HR凝胶柱上分离纯化。洗脱液为0.02 mol/L柠檬酸三钠(含0.2 mol/L NaCl，pH 7.2)，流速12 mL/h，

10、分步收集洗脱液，用Wallac1470 计数仪测定洗脱液的放射性计数。在放射性峰处同时监测蛋白浓度。经凝胶柱纯化后的样品用高效液相色谱法鉴定放射性化学纯度。125IRACD20的放射性化学纯度>98%。分 析 化 学第37卷第10期董增祥等：两种基于RAJI细胞的抗CD20单抗新型定量方法的比较及在药物代谢动力学中的应用 2.2.3 RAJI细胞的制备和固定 采用甲醛Triton X法固定RAJI细胞以。取对数生长期的RAJI细胞，离心，用PBS洗涤一次，加入4 预冷的0.5%甲醛PBS溶液34 mL，4 固定30 min以上。经1000 r/min离心10 min后，用PBA(含0.1

11、%叠氮钠，0.1% BSA的PBS溶液)溶液洗涤一次。在4 用2 mL 0.1% Triton X100PBS溶液处理3 min。1000 r/min离心10 min，用含1% BSA的PBS溶液洗涤一次，离心，以RPMI1640培养液调整至适当的细胞浓度。2.2.4 流式细胞法测定RACD20标准曲线制备和样品前处理 用PBS将RACD20标准品稀释至400 mg/L，然后连续两倍倍比稀释至0.05 mg/L13，即标准浓度为200，100，50，25，12.50，6.25，3.20，1.60，0.80，0.40，0.20，0.10和0.05 mg/L。各浓度的标准品加入等体积10 mg/L

12、的FITCRACD20。实际样品测定时，用PBS将待测定样品中抗CD20抗体浓度按一定倍数稀释至标准曲线范围内，加入等体积10 mg/L FITCRACD20。取对数生长期的RAJI细胞，计数，调整细胞密度至2×106/mL，然后将细胞悬液分至流式专用管中，100 L/管。将标准品的序列稀释液及待测样品加入分好细胞悬液的流式管中，100 L/管，每一浓度设2个复管，PBS为空白对照，冰浴避光45 min。PBS洗涤细胞2次，2000 r/min离心5 min，重悬于300 L PBS中。流式细胞仪测定荧光强度MCF(Mean channel fluorescence)。2.2.5 放

13、射免疫法测定RACD20标准曲线制备和样品前处理 用PBS将RACD20标准品稀释至80 mg/L，然后连续两倍比稀释至0.02 mg/L，即标准浓度为40，20，10，5，2.50，1.25，0.60，0.30，0.15，0.08，0.04及0.02 mg/L。每个浓度的标准品加入等体积30 mg/L的125IRACD20。实际样品测定时，用PBS将待测定样品中抗CD20抗体浓度按一定倍数稀释至标准曲线范围内，加入等体积30 mg/L的125IRACD20。取对数生长期的RAJI细胞，计数，调整细胞密度至2×106/mL，然后将细胞悬液分至计数仪专用管中，100 L/管。将标准品的

14、序列稀释液及待测样品加入分好细胞悬液的管中，100 L/管，每一浓度设两个复管，PBS为空白对照，冰浴避光45min。PBS洗涤细胞两次，2000 r/min离心5 min，重悬于300 L PBS中。Wallac1470 计数仪测定放射性计数CPM(counts)。2.2.6 结果计算 用MicroCal公司Origin 5.0软件对浓度对数X和各管样品响应值Y(FCA为MCF，IRA为CPM)绘制标准曲线，四参数Logistic拟合：Y=(Emax-Emin)(1+(X/EC50)slope)+Emin其中，Emax和Emin分别为S形曲线的最大值和最小值;EC50为50%响应值对应的浓度;Slope为斜率，即响应值随RACD20浓度的变化率。用同一批次设置的标准曲线，计算样品中RACD20浓度。3 结果与讨论3.1 方法的选择目前，检测Rituximab浓度的方法主要为ELISA，使用多抗14,15或单抗16,17针对Rituximab结构中来源于鼠的FV片段直接结合，过程复杂。已有文献报道使用流式细胞仪来检测与CD52结合的抗体CAMPATH1H 的浓度18。本研究采用细胞表面表达大量CD20抗原的RAJI细胞，建立了基于RAJI细胞的RACD20的测定方法：流式细胞法和放射免疫法。3.2 方法的评价3.2.1 特异性 与正