Bcl-2反义寡核苷酸对顺铂诱导肺癌细胞凋亡的促进作用

1、    Bcl-2反义寡核苷酸对顺铂诱导 肺癌细胞凋亡的促进作用        【摘要】目的研究凋亡抑制基因bcl-2的反义寡脱氧核苷酸（ODN）对顺铂诱导肺癌细胞凋亡的促进作用。方法选择表达bcl-2的肺癌细胞培养传代，分成7组：ODN组、无意序列组、ODN+顺铂、无意序列+顺铂、顺铂组、脂质体组和空白对照组。以脂质体与bcl-2 ODN混合导入培养的相应组肺癌细胞中，培养6 h后，相应孔加入抗癌药顺铂，再培养16h终止细胞培养并做细胞涂片，每组重复6孔。用免疫细

2、胞化学检测bcl-2的表达。采用TdT介导的dUTP末端标记法(TUNEL)原位观察癌细胞凋亡，并计算平均凋亡指数（AI）。结果经ODN处理的癌细胞bcl-2表达明显减弱，抑制有效率为60.8%。 凋亡的癌细胞胞核染成棕褐色。ODN+顺铂组AI为16.4±1.7，ODN组AI为5.9±0.2，顺铂组AI为4.1±0.8，无意序列组AI为3.3±0.7，无意序列+顺铂组7.6±1.1， 脂质体组AI为5.1±0.9，空白对照组AI为3.6±0.6。ODN+顺铂组AI明显高于其他各实验组，P<0.01。ODN组与顺铂组的A

3、I之和明显小于ODN+顺铂组，P<0.01。结论bcl-2反义寡核苷酸能够促进顺铂诱导肺癌细胞凋亡的发生。【关键词】bcl-2；反义寡核酸；顺铂；肺癌；凋亡Bcl-2 antisense oligodeoxyribonucleotide increases apoptosis of lung carcinoma cells induced by cisplatinOUYANG Nengtai， RAN Pixin， QIU Zhihui，et al.(Guangzhou Institute of Respiratory Disease， Guangzhou Medical College

4、， Guangzhou 510120，China)【Abstract】ObjectiveTo study the effect of antisense oligodeoxyribonucleotide (ODN) to apoptotic suppress gene bcl-2 on apoptosis of lung carcinoma cells induced by cisplatin.MethodsThe lung carcinoma cells expressing bcl-2 were chosen to take experiment. Cultured cells were

5、divided into 7 groups： ODN； nonsense； ODN+cisplatin； nonsense+cisplatin；cisplatin；lipofectin and control. Bcl-2antisense or nonsense mixed with Lipofectin was added into above corresponding cultured cells. After cultured for 6 hours， cisplatin was added into corresponding groups. The cells were cult

6、ured again for 16 hours. And then， the cells were smeared on the slides. Apoptotic cells were labeled with TdT-mediated dUTP nick end labeling (TUNEL) method on cell smears. Apoptotic index (AI) was counted to show the percentage of apoptotic cancer cells. The immunocytochemistry was used to detect

7、the expression of bcl-2 in carcinoma cells.ResultsThe bcl-2 expression of cancer cell in ODN group was significantly decreased compared to the control and nonsense groups； The AI of ODN+cisplatin group was 16.4±1.7，cisplatin group 4.1±0.8，antisense group 5.9±0.2，nonsense group 3.3

8、7;0.7，nonsense+cisplatin7.6±1.1，lipofectin5.1±0.9， control group 3.6±0.6. The AI of antisense+cisplatin group was significantly higher than that of other groups.ConclusionAntisense oligodeoxyribonucleotide to bcl-2 can inhibit significantly the expression of bcl-2 of lung cancer cells

9、 and increase apoptosis of cancer cells induced by Cisplatin.【Key words】bcl-2；Antisense oligodeoxyribonucleotide；Cisplatin；Lung cancer；Apoptosis细胞凋亡的研究近年来取得了很大的进展。一些调控细胞凋亡的基因已被证实。其中以凋亡抑制基因bcl-2的研究较为清楚。bcl-2的过表达抑制肿瘤细胞凋亡的发生。大剂量的抗癌药引起癌细胞的坏死，而小剂量的抗癌药则诱导癌细胞的凋亡1， 2。在阻断bcl-2的表达后是否能增加抗癌药诱导肺癌细胞的凋亡，目前文献报道较少。本

10、研究采用硫代正磷酸修饰的反义寡核苷酸(antisense phosphorothioate oligodeoxyribonucleotide， ODN）抑制肺癌细胞bcl-2的表达，观察ODN对抗癌药诱导肺癌细胞凋亡的作用。材料与方法一、材料1癌细胞的培养：取腺癌病人胸腔积液（7例中1例bcl-2阳性），分离癌细胞，以含10%小牛血清的RPMI1640培养液培养。隔天换液1次。经34次换液后，悬浮生长的淋巴细胞基本被清除。癌细胞经涂片免疫组化证实bcl-2阳性即可被用于下列实验。2.bcl-2 ODN的转染：针对bcl-2密码序列的寡脱氧核苷酸参照Ziegler等2， 3和Cotter等的设计

11、，由中科院上海细胞生物研究所合成。ODN序列为：5-GTTCTCCCAGCGTGTGCCAT-3，无意义序列为5-TACCGTGTGCGACCCTCTTG-3，并经硫代正磷酸修饰。脂质体(lipofectin)购自美国Life Technologies公司，预实验测定终浓度40 g/ml无细胞毒性（指与对照组比细胞凋亡指数无区别），按说明书稀释脂质体， 与ODN 51混合备用。bcl-2单克隆抗体为丹麦DAKO公司产品， 免疫组化试剂盒购自福州迈新公司。原位细胞凋亡检测试剂盒为德国Boehringer Mannheim公司产品。二、方法1.ODN及抗癌药对肺癌细胞的作用： 肺癌细胞以含10%胎

12、牛血清的RPMI 1640培养液于37 、5% CO2条件下培养。在细胞对数生长期，经胰酶消化，用培养液重新悬浮，细胞计数后以1×105/孔铺入24孔培养板中。细胞分为7组：ODN组；无意义序列组；ODN+顺铂组；无意义序列+顺铂组；顺铂组；脂质体组；空白对照组；每组6孔。细胞培养12 h后换液，每孔定量加入2 ml培养液，相应孔分别加入与脂质体混匀的寡核苷酸至终浓度5 g/ml，脂质体组仅加脂质体。培养6h后，相应孔加入顺铂至终浓度10 g/ml（药物浓度由预实验确定，单独使用不引起细胞的明显死亡），继续培养，于16 h分别收集每组6个孔的细胞，磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗，做成细胞

13、涂片，每孔涂片3张，4%多聚甲醛固定备用。2. 免疫组化检测bcl-2的表达：按链霉卵白素生物素(S-P)试剂盒说明，将细胞涂片经微波处理，0.1%Triton X-100作用5 min，常规法加一抗、二抗等，3，3二氨基联苯胺(DAB)显色。3.TdT介导的duTP末端标记(TUNEL)法检测凋亡细胞：主要过程按试剂说明书进行：(1)固定好的细胞涂片于0.01 mol/L枸橼酸盐缓冲液(pH6.0)中微波750W处理 2 min，冷却20 min， PBS洗2次5 min/次； (2) 0.1%Triton X-100 作用5 min；(3) 3%过氧化氢10 min， PBS洗2次5 mi

14、n； (4)入10%胎牛血清中作用30 min， PBS洗2次5 min； (5)加入TUNEL工作液， 室温下孵育90 min， PBS洗3次5 min； (6)加入辣根过氧化物酶标记的抗荧光抗体(Converter-POD)， 原液12稀释，室温下孵育40 min， PBS洗3次5 min； (7)DAB显色， 苏木素浅染， 中性树胶封片。4.观察指标：免疫组化结果根据阳性细胞的多少及染色深浅分为(+)，(+)，(+)。TUNEL染色每张涂片计数500个细胞，阳性细胞数占总细胞数的百分率，即为凋亡指数(AI)。采用卡方检验进行数据的统计学处理。结果一、TUNEL标记结果凋亡的癌细胞经TUN

15、EL法染色，细胞核染成棕褐色（1，2）。各组癌细胞的凋亡指数如下：ODN组5.9±0.2，无意序列组3.3±0.7，ODN+顺铂组16.4±1.7，无意序列+顺铂组7.6±1.1，顺铂组4.1±0.8，脂质体组5.1±0.9，对照组3.6±0.6。经卡方检验，ODN+顺铂组AI明显高于其它组(P<0.01)。而ODN组与顺铂组的AI之和为10.0±0.8， 明显<ODN+顺铂组，P<0.05。ODN组、无意序列组、顺铂组、脂质体组和对照组之间差异无显著性(P>0.05，3）。1示对照组肺癌细

16、胞的凋亡较少TUNEL×1002示ODN+顺铂组癌细胞的凋亡明显增加TUNEL×1003ODN和顺铂对肺癌细胞凋亡的影响二、免疫组化结果未经任何处理的空白组癌细胞bcl-2阳性较强（+）(4)。经ODN处理的癌细胞bcl-2弱阳性（+），表现为20.5%的细胞呈阴性，41.3%的细胞呈弱阳性，抑制有效率为60.8%(5)。仍有部分细胞呈强阳性。ODN组和ODN+顺铂组共12孔细胞结果类似。4示对照组肺癌细胞bcl-2表达呈强阳性免疫组化×2005示OND+顺铂组部分癌细胞bcl-2表达呈弱阳性免疫组化×200讨论大剂量的抗癌药引起癌组织的坏死并导致患者的

17、细胞毒性反应。小剂量的抗癌药可诱导癌细胞的凋亡4。癌细胞发生凋亡时，形成被膜包裹的凋亡小体并由周围的组织细胞吞噬，可不出现细胞毒性反应。故能促进癌细胞凋亡的因素对恶性肿瘤的治疗效果具有重要意义。本组采用的TUNEL法检测凋亡细胞是目前公认的原位检测凋亡细胞的最敏感方法，是通过对DNA断裂点的标记而显示凋亡细胞的，可检测到凋亡细胞较早期的改变。经修饰过的反义寡核苷酸通过与细胞中目标DNA或mRNA相结合，阻止其转录及翻译等过程，从而抑制其表达。这一方法已广泛应用于体内和体外的研究5， 6，如何将ODN有效地导入细胞中是关键。虽然脂质体有助于这一过程，但其本身对细胞的毒性必须要考虑。脂质体的剂量太

18、小对反义核酸的转录有影响，本组实验所采用的剂量只是对细胞凋亡无明显影响。总的说来，尽管阻断表达的效率尚有待提高，但由于其操作简便及容易控制，仍不失为一种较好的方法。bcl-2基因的表达在抑制细胞凋亡中的作用已被大量基因转染实验所证实，是目前认为与凋亡关系最为密切的基因之一。在20%50的肺癌组织中有bcl-2的过度表达7，8。bcl-2是一种与细胞器相关联的稳定蛋白，主要位于线粒体外膜、核膜和内织网膜等部位。本组研究结果显示单独使用bcl-2反义寡核苷酸不能明显引起癌细胞的凋亡，小剂量抗癌药亦不能诱导强表达bcl-2的肺癌细胞凋亡，而在阻断bcl-2表达后，抗癌药则能明显诱导癌细胞的凋亡，说明

19、反义寡核苷酸可有效地抑制bcl-2的表达，并进而能促进抗癌药诱导肺癌细胞的凋亡。这为以基因治疗与化疗相结合来提高肿瘤的治疗效果提供依据。至于bcl-2的作用机制，估计是在细胞凋亡过程的中间环节起负调节作用。有作者认为bcl-2是通过阻止氧自由基对脂质的氧化而抑制氧化剂对细胞凋亡的诱导。但详细的作用机制尚不十分清楚。 基金项目：卫生部科研基金资助项目和广州市科委科研基金资助项目(96-Z-58-2)欧阳能太（呼吸疾病研究所 广州510120）冉丕鑫（呼吸疾病研究所 广州510120）邱志辉（呼吸疾病研究所 广州510120）丁静（呼吸疾病研究所 广州510120）钟南山（呼吸疾病研究所

20、 广州510120）参考文献1，Zangemeister-Wittke U， Schenker T， Luedke GH， et al. Synergistic cytotoxicity of bcl-2 antisense oligodeoxynucleotides and etoposide， doxorubicin and cisplatin on small-cell lung cancer cell lines. Br J Cancer，1998，78：1035-1042.2，Ziegler A， Luedke GH， Fabbro D， et al. Induction of apoptosis in small-cell lung cancer cells by an antisense oligodeoxynucleotide targeting the bcl-2 coding sequence. J Natl Cancer Inst，1997，89：1027-1036.3，Cotter FE， Johnson P， Hall P， et al. Antisense oligonucleotides suppress B-cell lymphoma growth in a SCID-hu mouse model. Oncogene，