973课题结题报告

1、1973 课题结题报告课题名称：大豆重要新基因的发掘与有效利用研究课题编号： TG1998010206负责人：喻德跃承担单位：南京农业大学、中国农科院品资所、吉林省农科院协作单位：中国科学院遗传发育所2003年10月15日2、计划任务完成情况（一）计划任务本课题的任务：发掘大豆抗花叶病毒、抗食叶性害虫、产量有关性状、育性恢复系等新基因，明确遗传规律，并进行标记和定位。具体指标如下：1、抗大豆花叶病（SMV）基因方面：（1）标记到23个抗性基因,纳入遗传图谱;（2）育成抗性品系12个，作为育种新种质。2、 抗食叶性害虫基因方面：（1）标记到12个抗性主基因，纳入遗传图谱；（2）育成抗性品系12个

2、,作为育种新种质。3、 产量有关性状基因方面：（1）标记到34个产量有关性状的基因位点,纳入遗传图谱；（2）育成具2-4种特异性状的优良共同遗传背景家系（类似近等基因系）,用于聚合重组。4、 质核互作雄性不育恢复基因方面筛选与恢复基因紧密连锁的分子标记10cM对恢复基因进行定位。5、 发表SCI引用论文五篇以上。（二）完成情况本课题鉴定出一批新的基因资源， 包括：抗SM（133份）、感SM（122份）、3抗食叶性害虫（9份）、感食叶性抗虫（10份）、产量性状（8份）、恢复系（10份），建立了重组近交家系群体（RIL）8个。定位了9个新基因，获得分子标记10个，培育一批有育种价值的中间材料。共计

3、发表论文25篇，其中SCI收录6篇，国际特邀报告5篇,专著1部,培养研究生11人。总体上超额完成了任务目 标。（三）主要进展1、资源鉴定与群体培育（1）抗大豆花叶病毒（SMV方面鉴于国内大豆SMV株系鉴别寄主体系的混乱，在已经使用过的25个鉴别寄主中选拔出8个代表性寄主组成一套新的鉴别体系。 在长江中下游地区广泛采集 病样 （近300个样） ，以寄主鉴定为主、 结合SMV勺组织印迹检测技术和RT-PCR检测技术， 发现自20世纪80年代至今，SMV群体已经产生根本改变，尚未发现 原先鉴定过的株系。根据新鉴别体系的鉴定结果，确定了10个新株系（SC-1至SC-10），其中SC-8为强毒性株系群。

4、发现：SMV株系群组成复杂，同一株系群在不同地区的流行存在差异，同时不同株系群在同一地区的分布也有所 不同。综合1998-2002年的分析结果，认为：在株系组成上，黄淮地区以SC-3和SC-7为主。长江中下游地区以SC-9为主。测定了106份大豆品种（品系）对SC-7、SC-& SC-9三个株系群的抗性反应， 筛选出17份对三个株系均表现高抗的材料；18份能兼抗三个株系中的两 个株系的材料。构建了抗X感杂交组合衍生的RIL群体：科丰1号X南农1138-2 , F7：12，206个家系 （见表1）。用东北3号株系（SMV3对355份大豆种质资源进行了SMV抗性鉴定（包括七五”初鉴抗SMV

5、材料40份，“八五”初鉴抗SMV材料91份，各地推广品种100份，农科院品资所新育成的品系35份，美国引进材料42份，韩国引进材料36份，泰国2份，日本1份）。共筛选出116份高抗资源，117份中抗材料，122份高感资源。4（2）抗食叶性害虫基因方面综合1993-2002年的田间鉴定结果， 获得一批高抗食叶性害虫和高感食叶性害虫的大豆种质。高抗（HR的品种9份：黄皮小青豆、日本、Larmar、PI227687、 矮杆黄、York、阜阳170、SP26早16号，抗（R）的品种15份，表现中间（M） 的品种17份，感（S）的品种7份，高感（HS的品种10份：大浦大粒黄、中 豆19、南农86-4、南

6、农86-4、江宁中老鼠豆、监利牛毛黄、花柒黄毛豆、沔阳 白毛豆、吴江青豆、PI229358。合成重组近交家系群体2个，包括： 先进2号（感）X赶泰-2-2（抗）已推进到F7:9世代，含162个家系；和 皖82-178（感）X通山薄皮黄豆甲（抗） 也推进到F7：9代，含159个家系（见表1）。（3）产量性状基因方面获得了与提高产量潜力有关的资源8份，包括百粒重高（40g）、主茎节数 多（30）、短叶柄（10cM）、曲茎、顶生长花序等。构建了RIL群体2个，包括：南农87-23 X NG94-156（F?:8，175个家系）;波高（963069）X NG94-156（F7：8，156个家系）。（见

7、表1）（4）恢复基因方面获得利于大豆杂种优势应用的恢复系：10个。阐明了细胞质不育的遗传模式：以栽培大豆不育系YA保持系YB和含有不育细胞质的原始母本167为基础材料，配制了二个单交组合，四个三交组合，根据后代的育性和分离比例判断遗传模式。试验结果表明：S(Rfrf)基因型Fi花粉为半不育，F2可育与半不育分离比例为1：1；母本为不育细胞质S时，携带rf的雌配子有生活力，能传给后代，而携带rf的雄配子无生活力，5不能传给后代。母本为正常可育细胞质N时，携带rf的雌、雄配子均有生活力，可传给后代。分离比例是单基因遗传模式。因此该不育系属“单基因配子体不育”，即不育性由不育细胞质基因S和一对隐性基

8、因rfrf控制，一个显性基因Rf的存在即可恢复育性。明确了育性的稳定性：利用人工气候箱，设不同温度和光照长度处理，研究野生型大豆细胞质雄性不育系0A和保持系0B的育性稳定性。鉴于试材原产于高温短日照的夏大豆区，本试验以14小时光照和昼夜温度30C/20C为对照处理，在14小时不变光照条件下， 温度处理为35C/25C,30C/20C,25C/15C；在昼夜温度固定为30C/20C条件下，光照处理为15.5小时，14小时，12.5小时。在上述所有处理中，不育系OA花粉败育率均保持在99%以上。只有保持系在15.5小时光照时，花粉败育率上升到14.3%，这一结果表明，不育系OA在温度与光照大幅度变

9、化的情况下，不育性极为稳定。从细胞学方面明确了不育发生的时期：细胞学观察发现该不育系小抱子减数分裂正常，绒毡层亦无明显异常，不育发生的时期是在单核期以后。表1本课题培育的RIL群体名称世代主要性状差异群体大小亲本NJ(RS)XGF7:9抗感食叶性害虫161早先进2号(感)$赶泰-2-2（抗）NJ(RS)WTF7:9抗感食叶性害虫159早皖82-178（感）$通山薄皮黄豆甲（抗）NJ(SP)NNF7:8株形差异175早南农87-23（直萃）$NG94-156（曲茎）NJ(SP)BNF7:8株形差异156早波高（直茎）$NG94-156（曲茎）6NJ(RN)P7F8:10抗感抱囊线虫258早Pek

10、ing(抗)$7605(感)NJ(RN)R7F8:10抗感抱囊线虫256早RN-9(抗)$7605(感)NJ(TF)SXF2:7豆腐产量指标184早苏88-M23（低）$新沂小黑豆（高）NJRIKYF7:12抗感大豆花叶病206早科丰1号（抗）$南农1138-2（感）2、新基因发掘与分子标记抗大豆花叶病毒（SMV基因方面通过对P（科丰1号）、R（南农1138-2）、Fi和F7：ii184个家系的田间抗性鉴定和遗传分析，发现科丰1号对SMV株系群SC-7、SC-8、SC-9的抗性分别由一对显性基因控制，并将Rsc-7、Rsc-8、Rsc-9基因定位于N8D1b+W连锁群上，与已经定位的三个抗性基

11、因（RsaRn1、Rn3位于同一连锁群，成簇排列。此外，筛选到与抗性基因连锁的SCAR标记和RAPD标记，距Rsa和Rsc的距离分别为16.1和9.7cM。由于SC-7、SC-8、SC-9是新鉴定的SMV株系群，而鉴定的抗性基因位点与已经发现的SMV抗性位点位置不同，因而初步认为：Rsc-7、Rsc-8、Rsc-9是新的抗SMV基因。此外，选育出NJR25-8 NJR32-8 NJR-44-1等综合性状优良、抗性好的中间材料利用高抗SMV3号株系的大豆品系95-5383与感病品种（品系）HB1,铁丰21,Amsoy Williams，和抗病品种PI486355配制杂交组合，对各组合的Fi、F2

12、代接种SMV3号株系进行抗性鉴定，结果表明，95-5383与各感病品种的杂交组 合Fi代表现为感病，抗病为隐性，F2群7体分离比例为1R:3（ S+N，表明95-5383对SMV3号株系的抗性是受一对隐性基因控制。PI486355X95-5383的F2代有感病 植株分离，95-5383的抗病基因与PI486355不在同一位点。利用BSA法对95-5383 HB1的99株F2个体进行鉴定，筛选出与SMV抗病基 因紧密连锁的共显性RAPD标记OPN110/107。RAPESI物OPN1在95-5383和抗池 扩增出OPN11。片段，在HB1和感池扩增出OPN117。片段，在F1同时扩增出OPN11

13、。和OPN117。 用该引物分析95-5383 HB1的F2个体，共显性的RAPD标记OPN 1 10/1070与抗病基因的遗传距离为2.1cM。从95-5383和HB1中分别回收OPN11。和OPN117。特异片段，序列分析结果 表明OPN11。和OPN1170的实际长度分别为986bp和1084bp,同源性为93.4%,主要差别是在两个不同区段插入（缺失）54bp和35bp的碱基。用克隆的RAPD片段OPN11o作探针 （SOPN1） 对亲本基因组DNA进行Southern杂交， 结果表 明OPN11o和OPN1170在大豆基因组中是以低拷贝形式存在。根据克隆片段OPN11o和OPN117

14、0的序列设计合成了一对SCAF引物SCN11 SCN11在95-5383、HB1和95-5383 M4B1的F2群体扩增结果与RAPE引物OPN1忧全吻合。用RAPE引物OPN1和RFLP探针SOPN1分析科丰1南农1138-2重组近交 群体（南京农业大学/中国科学院遗传发育所联合构建），将OPN1和SOPN1定位于F连锁群的抗病基因簇上。由于95-5383 PI486355的F2代接种后有感病植 株分离且抗病基因位于F连锁群上与Rsvl不等位，表明可能定位的是新的抗病 基因。此外，用0PN1份析了68份抗性资源，其中有25份扩增出0PN11。，表明 这些品种可能携带与95-5383相同的抗性

15、基因，而其它扩增出OPN19180/1070和OPN1170的抗性品种可能携带不同于95-5383的抗性基因。（2）抗食叶性害虫基因方面阐明大豆对食叶性害虫的抗性属于两对主基因加多基因的遗传模型。 应用皖82-178 X通山薄8皮黄豆甲衍生的RIL群体在田间对纵合虫种进行鉴定，发现大 豆对食叶性害虫综合虫种的抗性由两对主基因加多基因控制。 两对中效应较大的 一对加性效应为10.5-10.7 （叶面积损失率, %）,效应较小的一对加性效应为4.4-7.2（叶面积损失率, %）,而且两对主基因的遗传率较高,达81.1-94.1%,多基因的遗传率较低,为0-12.2%。同样，应用皖82-178 X通

16、山薄皮黄豆甲衍 生的RIL群体在室内对单一虫种斜纹夜蛾进行养虫试验， 也发现大豆对该虫种的 抗性由两对主基因加多基因控制，主基因的遗传率为51.4%。抗虫基因（QTL有关的分子标记及定位。应用皖82-178（感）X通山薄皮 黄豆甲（抗）衍生而成的重组自交系群体（1 40个家系）开展养虫试验，研究各家系对斜纹夜蛾发育的影响，发现各家系对斜纹夜蛾发育的影响差异很大。采用178对SSR引物筛选亲本间的多态性，除无带的引物外，亲本间有多态的引物有52对，然后用这52对引物逐一筛选群体单株，对表型值（幼虫重、蛹重）与标 记值作相关分析，找到与控制大豆抗虫QTL相连锁的SSR标记Satt135、Satt3

17、63、Satt442，分别位于D2 H、C2连锁群上，其中Satt442可以解释8.7%的变异。而这些标记与所发表的抗玉米穗螟（美国大豆的重要食叶性害虫）基因的标记在 遗传图谱上的位置不同，因而认为可能与新的抗食叶性害虫基因有关。此外,选育出NJ89-30等优良抗虫品系。（3）产量性状基因方面遗传分析表明，曲茎亲本NG94-156的基因型可能是sbisbisb2sb2，直茎亲本NJ90L-2的基因型可能是SbiSbisb2Sb2或sbisbiSbSb,NJ87-23、963069的基因型可能是SbiSbiSb2Sb2o公交7622-4-1-4的短叶柄性状由一对隐性基 因控制。而株高、节间长度、

18、叶形这3个性状的遗传在大多数群体中都符合2对主基因加多基因的遗传模型。曲茎、短叶柄性状基因的分子标记与定位：用260个RAPD随机引物对9三个组合的4个亲本（南农88-31、波高、南农87-23、NG94-156）进行了 初步筛选，后用父、母本分别为NG94-156和波高的RIL后代家系（157个家系）进行筛选,发现其中有1个引物S-506扩增出的多态性条带有较好的 重复性。经过连锁分析，发现RAPD标记S-5061600与曲茎基因的遗传距离为6.94cM。此外，应用181对SSR引物筛选波高和NG94-156,发现50对引物在亲 本间表现多态性，经过RIL后代家系（157个家系）进行验证，发

19、现Satt534和Satt063与曲茎性状基因连锁，遗传距离分别为15.55 cM和9.68 cM,位 于连锁群B2。短叶柄基因连锁的分子标记：采用BSA法，从260个引物中筛选出6个能扩增出多态性条带的引物，经后代单株的验证，只有S-1扩增出的多态性 条带有较好的重复性。按极大似然法计算RAPD分子标记S-11900与短叶柄基因的遗传距离为14.36cM国内外还没有关于曲茎性状基因和短叶柄性状基因的分子标记的报道。（4）恢复基因方面用不育系与恢复系构建了F2分离群体，该群体中可育株与半不育株的比例 为1：1；利用不育系、恢复系、保持系构建了三交群体，该三交群体中半不育 与不育株的比例为1：1

20、。对所构建的三交和F2群体的带有可育、 半不育、 不育性状的Pool进行了大 量的SSR检测，400多对SSR引物，发现SSF标记Satt414在不育池和可育池之 间存在差异。将进一步单株分析结果利用Joinmap软件进行作图， 将恢复基因定 位于J连锁群，与SSR标记Satt596、Satt414的距离分别为14.6与16.4cM。为了找到更为紧密的标记，将J连锁群上的标记对亲本进行分析，发现两个亲本 之间的多态性很低，为寻找紧密连锁的标记带来了一定困难。为此，利用J连锁群上的标记对8个不育系和7恢复系进行了多态性分析， 选出多态性高的不10育系辽-82和恢复系CK-P配制了杂交组合，构建了

21、F2分离群 体。取不育单株56个和半不育单株49个共105个单株进行SSR分析， 用Joinmap以Kosambi函数进行遗传作图，找到了与恢复基因紧密连锁的分子标记Satt547， 其与恢复基因的遗传距离为7.5cM。大豆恢复基因的分子标记在国内外未见报道。（5）根系、农艺、品质等基因方面根系与大豆耐旱、 营养吸收等方面关系密切。 利用科丰1号X南农1138-2 RIL群体及其遗传图谱，定位了与大豆根系形态有关的QTL发现有10个QTL位点（位于4个连锁群）与相对根重有关，其中Rwr3位于标记STAS8-20T和STAS8-15T之间，可以解释11.1%的遗传变异；Rwr3位于标记STAS8

22、-3T和STAS8-6T之间，可以解释24.7%的遗传变异。还发现，10个QTL与相对根总长有关，其中Rtlrl位于标记STAS8-20T和STAS8-15T之间，可以解释7.1%的遗 传变异；Rtlr2位于标记STAS8-3T和STAS8-6T之间，可以解释22.9%的遗传变 异。这些QTL的效应正在进一步验证中。利用同一个RIL群体，对开花日数、全生育期、株高、主茎节数、倒伏 性、百粒重、产量、每节荚数等八个农艺性状以及蛋白质含量、油分含量、 蛋白质油分总含量等三个品质性状进行了初步研究。在遗传图谱的基础 上，用复合区间作图法研究了上述性状的QTL位点。11个性状共检测到54个QTLs，每

23、个性状至少检测到3个QTL位点，全生育期和主茎节数甚至检测到13个位点。所有性状都有主效QTL（r20.1），效应最大的QTL（lg1，倒伏性）可以解释63.4%的变异。还检测到3个QTL与蛋白质含量 有关（最多解释10.8%的变异），4个QTL与油份含量有关（最多解释13.9%的变异）。在25个连锁群中，有14个连锁群上有QTL位点，其中N6-C2上的QTL最多，有17个。有14个QTL位点可以影响多个不同的性状，其 中开花日数的7个QTL都是这样的位点，这7个位点中，最多的可以影响116个性状，同一个位点对不同性状的影响是不同的。以高产品种郑92116和低产品种商951099杂交组合的F2

24、及F23家系为材料 进行农艺性状的QTL分析。该群体由125个单株组成，采用Mapmaker/EXP3.0软件对143个多态性SSR标记进行连锁图的绘制，其中26个标记与其它标记不 连锁，其余117个标记构成28个连锁群，该图谱覆盖了大豆1893.7CM,标记间 平均遗传距离为16.2cM。 其中22个标记间的遗传距离超过30cM,位于17个连锁群。在F2群体中检测到4个与株高有关的QTL，分布位于连锁群K，I，B1,L上，解释变异频率分别为10.9，1.7，10.3，34.6；在连锁群I的同一 区域，还检测到单株粒重、单株荚数、主茎节数的QTL各一个，解释的变异频率分别为10.2%,9.7%

25、和14.8%;在连锁群B1上还检测到一个与生育期有关的QTL解释变异频率12.4%。（6）新基因发掘原理与方法研究方面对植物数量性状的遗传体系进行了较深入的研究。对数量性状QTL检测从3个方面进行了拓展：a）分离世代的拓展，包括RIL和DH群体，Ei：2和B2：2群体；b）进行家系重复试验以减少试验误差提高遗传分析的精度；c）由1对主基因+多基因拓展至2对主基因+多基因。IECM算法的提出使以上拓 展精度大为提高，并成一体系。二、 研究水平与创新性本课题研究在大豆抗SMV基因、抗食叶性害虫基因、大豆雄性不育恢复基因 方面以及新基因发掘原理与方法（植物数量性状遗传体系）等方面的研究水平在 国内均具有领先地位。与国际同类研究相比，在新基因的发掘方面具先进地位， 但在相关基因的定位和标记的精度方面尚有一定的距离，需要进一步深入研究。12三、 实施效果大