复合因素诱发大鼠胃粘膜癌前病变的动物模型

1、    复合因素诱发大鼠胃粘膜癌前病变的动物模型         摘要目的：建立实用有效的动物模型，探讨胃癌前病变与胃癌发生的过程及机制。方法：采用符合国人引起胃癌及癌前病变的多种因素(化学致癌剂MNNG、酒精、胆汁等)进行组合诱发多组大鼠胃癌前病变模型，研究胃癌前病变异型增生(GED)、肠化生(IM)及胃癌之间的关系。结果：诱发2例腺胃腺癌(均为45周的MNNG普通组)，33例 腺胃GED，4例十二指肠及小肠腺癌(MNNG加强组3只，MNNG乙醇组1只)等；腺胃GED全部是

2、胃型，发生于幽门腺区27例，胃底腺区6例；各组均未观察到IM。结论：（1）建立的动物模型成功地诱发出胃癌及癌前病变；(2) MNNG诱发大鼠的胃腺癌及GED均来源于胃型上皮，在癌变及演进过程中，逐渐显示肠型特点，为肿瘤异质性表现，证明胃癌前病变亦具有异质性；(3) IM可能不是癌前病变。关键词胃粘膜；癌前状态；疾病模型，动物；大鼠中分类号R735.2文献标识码A文章编号1001-7399(2000)05-0406-03Gastric precancerous lesions in rat induced by composite factorsShi YuLi Lianhong（Sino-Ja

3、pan Clinicopathologic Center, Dalian Medical University,116027）ABSTRACTPurposeTo establish a practical and effective animal model in order to study the course and possible pathogenesis of precancerous lesions and cancer in stomach of rats. MethodsTo induce precancerous lesions and cancer model in ra

4、ts with various factors similar to that in human, such as N-methyl-N'-nitro-N-nitroso guanidine(MNNG), alcohol, bile and so on. Correlation of gastric epithelial dysplasia(GED) and intestinal metaplasia (IM) with gastric carcinoma was detected. ResultsTwo adenocarcinomas, thirty-three GED in gla

5、ndular stomach and four adenocarcinomas of duodenum or small intestine were induced. All thirty-three GED of glandular stomach were gastric type, in which six were in fundic gland area and twenty-seven in pyloric gland area. IM was not found in every group. ConclusionsExperimental gastric carcinoma

6、and precancerous lesions of rats were induced successfully with MNNG, alcohol and bile. Gastric carcinoma and GED of rats induced with MNNG are all derived from gastric type epithelia. During carcinogenesis progression, atypical epithelia are transformed gradually from gastric type to intestinal typ

7、e. It is demonstrated that not only the tumor but also precancerous lesions, appear to be heterogeneous. IM may be not a type of precancerous lesion.KEY WORDSgastric mucosa; precancerous conditions; disease models, animals; rats胃癌是最常见的恶性肿瘤之一1，一般认为其发生需经历多年持续的癌前病变，因此研究胃粘膜癌前病变及其与胃癌关系，对于正确认识和处理癌前病变、预防胃癌

8、发生具有重要的理论价值和临床指导意义。WHO于1972年提出胃癌前病变，包括胃粘膜上皮异型增生(gastric epithelial dysplasia，GED)、肠化生(intestinal metaplasia, 简称IM)等2。最近很多研究证实GED是一种重要的癌前病变，而IM作为一种癌前病变争议较大。有人认为IM不是癌前病变，而只是癌旁病变3。本研究模拟引起胃癌的复合因素诱发大鼠胃癌前病变模型，研究胃癌前病变(GED与IM)之间及其与胃癌之间的关系。1材料与方法11动物SD大鼠(本校实验动物中心提供，符合辽宁省实验动物一级标准)74只，体重165 g±8 g，各半，分笼饲养。

9、12药品N-甲基-N-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)购自日本片山工业株式会社。Tween-80购自大连医药集团化玻公司。去氧胆酸钠购自上海行知化工厂。13动物分组及实验方法第1组：MNNG普通组。10只,1 g/L MNNG生理盐水,5 ml/只灌胃,隔日1次,共10次,后改为0.1 g/L MNNG生理盐水自由饮10天。第2组：MNNG加强组。24只, MNNG溶于0.4% Tween溶液中1 g/L，5 ml/只灌胃，隔日1次，共20次，后改为自来水。第3组：MNNG胆汁组。10只, MNNG溶于0.4% Tween溶液中1 g/L, 5 ml/只, 0.2%去氧胆酸钠溶液2 ml/只,

10、隔日交替灌胃各10次。第4组：MNNG乙醇组。10只,MNNG溶于0.4% Tween溶液中1 g/L， 5 ml/只，60%乙醇 2 ml/只，隔日交替灌胃各10次。第5组：MNNG复合组。10只,MNNG溶于0.4% Tween溶液中1 g/L，灌胃 隔日1次, 共10次，间隔日以60%乙醇与0.2%去氧胆酸钠溶液各2 ml/只交替灌胃各10次。第6组:对照组。10只，正常饲养。实验共进行45周，于实验第20周开始每周均对各组中随机处死或病死的大鼠进行尸检，观察癌前病变生长情况。尸检时除对各主要脏器均取材外，重点对胃进行详细检查。将胃沿大弯侧剖开，平铺于硬纸板上，仔细观察记录胃粘膜肉眼改变

11、并照相。对可疑部位取电镜标本(1 mm×1 mm×1 mm大小)。余下部分置10%中性福尔马林溶液中固定。固定后沿小弯平行方向分块取材，每块宽0.40.5 cm，将全胃分成68块。石蜡包埋，4 m厚切片，分别经HE染色及PAS/AB(pH 2.5)染色。取电镜标本大鼠胃31例,经2.5%戊二醛固定，常规制样，在日本产JEM-2000EX型电子显微镜下观察拍照。14病理诊断标准胃粘膜上皮异型增生(GED)的诊断分型和分级参照吉井隆博提出的标准4。2结果21实验动物各种病变的病理观察211肉眼观察大部分病变发生在幽门腺区的小弯侧，包括2例腺癌、27例GED和5例胃溃疡，只有6例

12、GED发生于胃底腺区。胃粘膜表面常不光滑，皱襞减少，病变多为不规则的肿块，由粟粒大至黄豆大。直径110 mm。较大的病变呈菜花样肿物。212光镜观察实验组大部分大鼠的胃粘膜有病变，早期表现为不同程度的糜烂或溃疡，晚期则出现腺体的增生及不同程度的异型增生。2例胃癌出现于观察时间最长(45周)的MNNG普通组。经形态学和PAS/AB(pH 2.5)染色认定33例GED均为胃型(表1)，甚至在同一腺腔里呈现不同程度的增生，PAS/AB(pH 2.5)染色，显示PAS染色阳性。4例异型增生的细胞为胞浆嗜碱的主细胞型，腺体扩张呈圆形或椭圆形的囊腔，位于胃底腺区的腺体底部；2例为胞浆嗜酸的壁细胞型，腺体扩

13、张呈圆形或椭圆形的囊腔，也位于胃底腺区的腺体底部；2例为干细胞型，位于幽门,细胞较小、立方形、排列密集、形成比较长的隐窝，异型性大的隐窝较迂曲。表1腺胃GED的异型上皮类型及发生部位部位表面上皮型主细胞型壁细胞型干细胞型胃底腺区0420幽门腺区25002合计25422     22动物实验所致各种病变及其在各组发生情况见表2，各组均未发现肠化。23大鼠腺胃癌前病变的电镜观察可见异型细胞核增大，形状不规则，多呈杆状，有的核膜有皱褶凹陷；核常染色质增多，异染色质颗粒增粗，聚集成团块并靠近核膜内侧，有的核仁明显；胞浆内粗面内质网较丰富；有的具有粘液颗粒，细胞之

14、间有丰富的微绒毛。 3讨论表2化学致癌剂诱发大鼠胃癌、癌前病变及其它肿瘤结果(例)分组有效动物数腺胃腺癌腺胃GED腺胃溃疡前胃鳞状上皮异型增生前胃鳞状上皮乳头状瘤十二指肠及小肠腺癌胃底腺区幽门腺区MNNG普通组62021100MNNG加强组2204100123MNNG胆汁组100152220MNNG乙醇组90171221MNNG复合组80021210对照组100010000合计6526275874     31大鼠胃癌发生的过程胃粘膜的干细胞(增殖细胞)位于腺颈部并牢固附着于基膜，向上以“滚梯式运动”使有发达连接的表面上皮同步移动，不断更新；向下形成以单

15、个细胞移动、连接松散并具有分泌功能的腺上皮5。本实验虽观察到在动物实验早期，大部分大鼠的胃有糜烂或溃疡，但反复的损伤和修复本身不一定构成对干细胞致癌的原因。而处于增殖状态的干细胞，因受致癌剂损伤的基因可能难以及时修复，而产生可遗传的基因突变。如果同时胃粘膜上皮损伤严重，加速干细胞增殖，受致癌剂损害而突变的干细胞也增加，损伤部位将由这些突变的干细胞来源的上皮修复，并逐渐取代正常上皮而发生GED。向上发展为表面上皮型，向下发展为腺细胞型，或直接发展为未分化型。因为表面上皮最直接受损而最易形成表面上皮型(本实验表面上皮型GED最多)，但易流失；腺细胞型易由于细胞增生造成腺体出口堵塞，而致囊性扩张。3

16、2IM与GED和胃癌的关系本动物实验未见到IM，并且发生的2例腺胃腺癌和33例GED都是胃型上皮。 对大鼠的GED电镜观察发现，光镜形态学具有胃型上皮特点的异型上皮细胞，其超微结构却有肠型上皮的特点，提示在癌前阶段，异型上皮细胞就表现出差异，具有异质性。以上结果表明：(1) 化学致癌剂并不导致大鼠IM。这与Yamamoto等6报道一致。国内学者7复制大鼠胃癌模型，单纯给予MNNG自由饮未出现IM，而同时人工造成胆汁返流却有较高IM发生率。其原因可能是胃内pH值升高所造成的微环境诱导干细胞向肠上皮分化8；(2) 胃粘膜癌变过程中出现肠型特点是肿瘤异质性的表现。胃癌由胃型上皮发生，在癌变及进展过程

17、中，此胃型上皮表现出多样性，从而出现分化及功能上的差异，有的就表现肠型特点，这与Tatematsu等9通过大鼠诱癌实验所得结论一致，即癌前干细胞先发生胃型细胞变化，其中部分可继发肠型细胞的变化。国内张荫昌10在论述IM与胃癌关系时也指出：癌细胞与IM细胞在形态学上的共性，并不足以证明癌发生于良性肠化生细胞，正象正常胃粘膜在某些致病因素作用下可以化生一样，胃癌细胞在其癌变过程中也可以获得肠上皮或其它组织的特征。并有报告在弥漫型胃癌中看到了潘氏细胞，在弥漫浸润的单个癌细胞上看到了带有刷状缘的腺样结构。这实际上就是肿瘤异质性的表现。(3) IM可能不是癌前病变。有人11亦报道所谓IM亚型中的型IM，

18、经过盲法比较其与GED的形态学差异及核仁形成区嗜银相关蛋白(AgNORs)的计数差异，认为型IM是GED的一种。故型IM已不属于IM的范畴，因IM定义只是胃粘膜上皮被正常肠上皮取代而形成的一种化生8，12。本实验发现的球样异型增生有待进一步证实。基金项目：辽宁省教委资助项目(No 9707211067)作者简介：石宇，男，29岁，硕士研究生；李连宏，男，39岁，教授，硕士生导师作者单位：石宇（大连医科大学中日临床病理中心，大连116027）李连宏（大连医科大学中日临床病理中心，大连116027）参考文献1，李连弟, 张思维, 鲁凤珠等 中国恶性肿瘤死亡谱及分类构成特征研究 中华肿瘤杂志, 19

19、97;19(5):3233282，World Health Organization. Report of a WHO Meeting on the Histological Definition of precancerous lesions. Geneva:WHO, 19723，磨伊正义, 高木. 胃癌前癌病变见直. 癌化学疗法, 1995;22(14):202920374，吉井隆博著 胃病理 特组织像读方 第4版， 东京：医学书出版株式会社， 1985：1251435，藤田皙也 慢性胃炎癌 东京：协和发酵， 1982：36，Yamamoto M, Furihata C, Fujimitsu Y et al. Dose-dependent induction of both pepsinogenaltered pylor