吸入NO复合米力农治疗内毒素滴入气管内致兔早期急性肺

1、吸入NO复合米力农治疗内毒素滴入气管内致兔早期急性肺损伤安徽医科大学附属省立医院麻醉科谢言虎 李娟 章蔚 方才*摘要目的观察吸入NO复合米力农治疗内毒素滴入气管内致兔早期急性肺损伤的疗效。方法采用内毒素滴入兔气管内复制ALI模型，将30只兔随机分为正常组、模型组、NO和米力农治疗组、NO复合米力农治疗组。监测MAP、PAP、PaO2、Qs/Qt，采集血标本测NO、MDA，计算肺湿/干重比及BALF细胞总数、PMN百分比、蛋白含量，观察肺组织形态学变化。结果 NO和米力农治疗组PaO2提高，肺动脉高压下降，肺分流率下降，通气功能改善；BALF中PMN减少，炎症得到一定抑制，肺损伤程度减轻。NO复

2、合米力农组肺部通气功能改善较其他两组更加显著，BALF中PMN百分比显著下降，显微镜下肺泡扩张良好，肺泡间隔薄，只有少量炎性细胞。结论 米力农能增加内源性NO生成，有抗炎作用，具有一定的肺保护作用；NO复合米力农后，能更好的改善ALI肺部通气功能，降低肺动脉高压，具有更强的抑制炎症能力，有着更好的肺保护作用。关键词：一氧化氮 米力农 急性肺损伤 内毒素Inhaled nitric oxide combined with IV infused Milrinone in treatment of rabbits with lipopolysaccharide-induced acute lung

3、injury Xie Yanhu , Li Juan, Zhang Wei, Fang CaiAbstract Objective To observe inhalation of NO combined with iv infusion of Milrinone whether can improve gas exchange of acute lung injury. Methods 30 rabbits were anesthetized with tracheotomy, and then ventilated mechanically. Six animal were selecte

4、d as normal control. The 合肥 230001 安徽医科大学附属省立医院麻醉科 *为通信作者other were induced into ALI by LPS, and randomly allocated into four groups: (1) LPS control group(n=6,receiving ventilation only); (2)NO group(n=6, inhaling NO at 20ppm);(3) NO+Milrinone group(n=6, inhaling NO 20ppm combine with iv infusing M

5、ilrinone at 5g/kg.min after iv 50g/kg); and (4)Milrinone group(n=6,continous iv infusing Milrinone at 5g/kg.min after iv 50g/kg). The mean systemic arterial pressure (mSAP), PaO2 and Qs/Qt were recorded in the time of baseline ,LPS0min ,120min, 150min. Wet-to-dry weight ratio(W/D), total cells, PMN(

6、%) and protein contents in BALF were determined after treatment. Results The rabbits injuryed with LPS in inhaling 20 ppm NO or iv infusing Milrinone could rapidly reduced mPAP and Qs/Qt, increase PaO2,NO without inducing significant change of mSAP. Compared with the LPS control, total cells, PMN(%)

7、, and protein contents in the BALF significantly decrease too. These results suggest that inhaled NO or iv infused Milrinone could attenuate LPS-induced ALI and pulmonary inflammation . In addition, compared with NO or Milrinone group, inhaled No combined with iv infused Milrinone could significantl

8、y reduced mPAP, Qs/Qt, improved pulmonary gas exchange .and the indexes lung injury were lower than those groups. Conclusion Milrinone could increase endogenous NO , attenuate pulmonary inflammation, and have positive effect on preservation of ALI. Inhaled NO combined with iv infused Milrinone could

9、 significantly improve pulmonary gas exchange, and have stronger ability of attenuating pulmonary inflammation.Key words: nitric oxide, Milrinone, acute lung injury, lipopolysaccharide急性肺损伤(Acute lung injury)/急性呼吸窘迫症是指除心源性外的各种肺内外因素所导致的急性、进行性缺氧性呼吸衰竭，ALI是导致重症患者死亡的主要原因之一。近年来对ALI的发病机制和治疗进行了大量的基础和临床研究，但由

10、于发病机制复杂，治疗效果不佳，死亡率仍高达50%。一氧化氮（nitric oxide）是具有自由基活性的气体小分子，吸入NO可降低肺动脉压，改善肺部通气及氧和，不良反应小，但其半衰期短，长期治疗ALI效果不明显。米力农是属于磷酸二酯酶抑制剂，能降低肺动脉压,改善肺通气功能。二者复合应用治疗早期ALI，以期达到更好的疗效。1 材料与方法1.1 材料 新西兰家兔（由安徽医科大学实验动物中心提供），30只雌雄不拘，平均体重1.752.5kg，随机分为5组。脂多糖（LPS，colli.055B5, Sigma公司），米力农（5mg/只）（山东鲁南制药），NO和MDA试剂盒（南京建成），NO由南京特种气

11、体厂提供，瓶装氮气混合，浓度为788ppm，NO气体监测仪(英国bedfont公司)，呼吸机（纽邦E200），微量输液泵（贝朗公司），多功能监护仪（spacelab），血气分析仪（美国i-state） 1.2 实验分组 A组 ：正常对照组；B组：模型对照组；C组：NO治疗组在建模成功后(LPS0min)持续吸入20ppm NO120min；D组：NO复合米力农治疗组在建模成功后持续吸入20ppm NO120min，同时予以静注米力农50g·kg-1后以5g·kg-1·min-1持续输注；E组：米力农治疗组在建模成功后予以静注米力农50g·kg-1后以5g

12、·kg-1·min-1持续输注。停止治疗后继续观察30分钟。1.3 模型制作 术前肌注阿托品0.01mg/kg，行耳缘静脉穿刺开放通道静注3%戊巴比妥钠30 mg/kg。切开气管、插入气管导管,深度34cm，连接呼吸机行机械通气， VT 810ml·kg-1，F 25beat·min-1，I:E=1:2，FiO2=30%,间断追加戊巴比妥钠和万可松维持麻醉。切开皮肤, 显左股动脉,经左股动脉插入18G套管接压力换能器监测动脉压,右颈静脉插入20G套管以便采集血标本。沿胸骨左缘第二肋间打开纵隔及心包，行肺动脉置管，监测肺动脉压力。静滴生理盐水7.5ml/k

13、g·h。 待mPAP、mSAP稳定30分钟后开始实验。除正常组气管内滴入NS 2ml外，其他组滴入内毒素5mg/kg(NS 2ml), 待血气分析显示PaO2下降，氧和指数(PaO2/FiO2)<300,认为模型建立。开始治疗，在气管导管与呼吸机接口导入NO气体及NO监测仪，用微调流量计调节NO浓度，呼出NO经呼吸机排气管道排出室外。米力农静脉推注负荷量后以微量泵静注维持。对照组和模型组只吸入相同浓度的氧气1.4标本采集 在建模前、建模后0min、120 min、150 min，记录兔的平均动脉压、肺动脉压、呼吸频率等生命体征；抽取动静血做血气分析，计算肺内分流率（Qs/Qt）

14、；采集静脉血4 ml，3000r/min离心取上清液，-70冷冻保存待测丙二醛（MDA）、NO。1.5实验结束后 观察结束以10%KCl静脉注射处死动物。以10ml生理盐水灌洗右肺回收支气管肺泡灌洗液(BALF)约8ml，回收率大于80%，冲洗3次。取5毫升送检，取20l在显微镜下行细胞总数计数，其余2500r/min离心后涂片行瑞氏染色，计算多叶核细胞（PMN）比例；回收液经双层干纱布过滤后于43000r/min离心10分钟,吸取上清液-70保存，采用考马斯亮兰法测定蛋白含量。取左上肺称湿重，置于80烘箱内烘干24至恒重,称重并计算肺组织湿/干重( /)比值。取左下肺4%中性甲醛固定送病理检

15、查，观察肺组织形态学变化。1. 6血清NO和MDA检测按照说明书操作,NO采用硝酸还原法,MDA采用硫代巴比妥酸法.1.7 统计学处理 各组数据以x±s表示，通过spss12.0软件包统计处理，组间和组内比较采用重复测量的方差分析；同时采取多因素方差分析判断NO复合米力农治疗是否存在协同作用。2 结果2.1 mSAP、mPAP的变化 在滴入内毒素后mSAP逐渐下降，模型组在致伤后血压显著下降。各治疗组在治疗后mSAP较模型组变化不明显，差异无显著意义。mPAP在致伤后显著升高，经治疗后下降明显，差异有显著意义，停止治疗后逐渐回升。NO+米力农组mPAP下降则更为显著，停止治疗后回升幅

16、度要小于其他两治疗组。表1 mSAP、mPAP的变化(mmhg)baseline after LPS 0 120 150(min) mSAP mPAP mSAP mPAP mSAP mPAP mSAP mPAP正常组 115.8±6.2 12.8±1.5 114.7±4.7 12.2±1.5 114.1±5.0 12.2±1.9 113.0±8.0 12.2±1.5模型组 115.7±3.8 12.1±1.1 106.5±4.5 22.1±1.4# 88.7±4.0

17、 22.3±2.2 84.3±5.8 21.3±1.6NO 组 112.2±7.2 12.1±1.4 110.2±7.7 21.8±2.5# 99.7±5.5 13.0±1.4# 86.0±6.0 19.8±1.2NO+M组 114.3±7.8 11.8±1.2 105.8±6.3 21.0±2.2# 91.8±4.8 11.3±2.0# 92.0±3.7 17.2±1.5M组 109.7±8.5

18、 12.2±1.9 110.0±4.2 20.5±1.9# 93.3±4.3 14.5±1.1# 88.8±5.7 19.3±1.2 ：组内比较，P<0.05,组间比较P>0.05; #:组内与致伤前比较P<0.05; #:与致伤后比较,P<0.05; #:与其他治疗组比较差异显著,P<0.052.2 PaO2和Qs/Qt的变化 在致伤后PaO2显著下降,处于较低水平,经治疗后明显升高（P<0.05），NO+米力农组则较另两治疗组更为显著（P<0.05）。停止治疗后NO+米力农组Pa

19、O2没有明显变化，而另两治疗组则下降明显（P<0.05），但氧和仍好于致伤后。Qs/Qt在致伤后显著升高而治疗后 迅速下降；NO+米力农组下降最明显，且停止治疗后其Qs/Qt虽有所升高仍显著低于另两治疗组（P<0.05）。表2 PaO2(mmhg)和Qs/Qtbaseline after LPS 0 120 150(min)PaO2 Qs/Qt PaO2 Qs/Qt PaO2 Qs/Qt PaO2 Qs/Qt正常组 152.0±11.5 9.5±0.6 151.5±8.6 9.7±4.0 159.7±10.0 9.8±2.

20、5 157.7±5.4 9.7±0.3模型组 154.3±13.0 9.8±0.3 85.0±7.1 27.8±2.1 75.5±7.0 35.7±2.7 72.3±5.3 37.6±2.6NO 组 159.8±13.1 9.8±0.2 83.5±8.6 27.8±1.7# 134.2±14.0 17.6±1.4# 103.5±6.6 24.5±2.3NO+M组 158.3±16.4 9.8±0.

21、2 87.7±7.1 28.6±1.6# 146.0±13.1 14.8±1.6# 145.7±7.7 17.6±1.6#M 组 160.5±10.2 9.7±0.5 85.5±7.2 28.9±1.7# 132.5±6.0 17.0±1.2# 113.0±8.8 24.8±1.1, #：与致伤前比较，P<0.05；, # #:与致伤后比较, P<0.05；, #:与另两治疗组比较, P<0.052.3 NO和MDA的变化 在致伤后NO水

22、平明显下降,经吸入NO或米力农治疗后都有上升趋势, NO+米力农组则上升更加显著,且停止治疗后仍能维持在较高水平。MDA在致伤后由于脂质过氧化而过多产生，经治疗都显著下降，停止治疗后又有回升趋势。表3 NO和MDAbaseline after LPS 0 120 150(min)NO MDA NO MDA NO MDA NO MDA正常组 75.5±3.5 5.71±0.10 77.9±4.4 5.64±0.23 78.6±3.0 5.70±0.26 74.4±5.2 5.64±0.31模型组 77.3±

23、7.0 5.67±0.23 56.8±4.6 7.67±0.18# 52.9±4.7 8.03±0.35 51.3±4.5 8.29±0.31NO 组 74.8±4.9 5.61±0.27 58.3±4.4 7.60±0.22# 159.3±12.3 6.58±0.16# 86.4± 8.7 7.10 ±0.18NO+M组 75.3 ±6.0 5.57±0.30 54.5±2.6 7.69±0.24# 17

24、8.4±8.3 6.11±0.19# 124.7±8.4 6.43±0.17#M 组 79.1±5.2 5.76±0.12 58.0±4.4 7.64±0.19# 141.4±12.1 6.81±0.25# 102.0±5.5 7.23±0.27 , #：与致伤前比较，P<0.05；, # #:与致伤后比较, P<0.05；, #:与另两治疗组比较, P<0.052.4 肺湿/干重比、BALF指标的变化肺湿/干重比三治疗组均明显低于模型组（P<0.01

25、），NO+米力农组最低。BALF各指标中，致伤后细胞总数、PMN百分比、蛋白含量均显著上升，经治疗后各指标都明显下降，而NO+米力农组较另两治疗组更显著。表4 肺湿/干重、BALF指标肺湿/干重比 BALF指标 细胞总数（108/L） PMN（%） 蛋白含量（g/L）正常组 4.69±0.25 2.36±0.39 0.10±0.03 0.28±0.03 模型组 7.28±0.44 8.21±0.96 66.33±8.48 0.74±0.06NO 组 6.35±0.24 6.29±0.57 25.

26、50±5.68 0.55±0.07NO+M组 5.38±0.27# 6.04±0.47# 8.72 ±2.07# 0.45±0.05# M 组 6.22±0.29 6.77±0.55 31.00±5.10 0.56±0.06:与正常对照组比较,P<0.05；：与模型组比较，P<0.05；#：与另两治疗组比较，P<0.052.5 肺组织形态学变化 模型组：肺泡腔和小气道内有大量炎性细胞浸润,明显出血水肿。肺泡扩张或萎陷，肺泡间隔明显增厚。NO和米力农治疗组：肺泡扩张度略有改善，炎

27、性细胞浸润程度要好于模型组，肺泡间隔稍增厚，但肺泡及小气道仍有水肿、出血。NO+米力农治疗组：肺泡扩张较为均匀，肺泡壁较薄，只有少量的炎性细胞浸润，肺部出血、水肿、炎性细胞浸润与其他两治疗组相比，明显减轻。正常组(HE, 200) 模型组(HE, 200) NO组(HE, 200) 米力农组(HE, 200) NO+米力农组(HE, 200)2.6 NO复合米力农的协同效应 本研究采取析因设计,经多因素方差分析, NO+米力农治疗组治疗后,对PaO2、Qs/Qt、NO、MDA、PMN百分比作用有统计学意义，P<0.05，NO和米力农有交互作用，说明NO复合米力农治疗ALI有着协同效应。3

28、讨论3.1 NO与ALILPS作为致病因素，能直接损伤内皮细胞，激活中性粒细胞，促进炎性因子释放，导致肺动脉高压，诱发ALI。NO作为内源性血管扩张因子，也是细胞间信号传导的信使分子，主要由内皮细胞生成。能舒张血管平滑肌，对抗体内缩血管因子作用；作为抑制型非胆碱能非肾上腺素能递质，舒张气道平滑肌，扩张气管、支气管，减少肺内分流，改善V/Q提高氧和；且能减少PMN的肺内扣押，抑制中性粒细胞的激活，减少PMN趋化蛋白的表达，选择性抑制内皮细胞与中性粒细胞黏附等，保护内皮细胞；减少炎性因子的释放，减轻ALI时肺组织炎性反应，保护肺组织14。单纯吸入NO后，PaO2快速上升，肺内分流下降；肺动脉压力明

29、显下降。Cuesta等5发现胎粪吸入新生羊严重呼吸衰竭吸入NO后PaO2迅速上升，接近正常。临床研究中，ARDS患者吸入NO后亦证实有迅速而显著的氧和改善。我们研究结果也证实NO抑制炎症反应，改善肺通气功能。NO能减轻炎症反应,治疗后BALF中PMN比例明显降低,MDA也显著下降，MDA作为脂质过氧化的产物，能间接反应自由基水平，说明NO能够清除自由基，减轻上皮细胞损伤。NO主要通过NF-B对炎症反应进行调节的，NF-B活化后移位至细胞核内参与调节促炎细胞因子的合成，不同浓度NO可以调控NF-B的活化过程7。NO的治疗效果不但与吸入时间有关，更与机体所处的炎症阶段，依赖于组织促炎与抗炎之间的平

30、衡及机体氧化应激的严重程度。所以NO治疗ALI应尽早进行，早纠正缺氧，避免缺氧对全身脏器的损伤，控制炎症进一步发展，更有利于NO作用的发挥，提高治疗效果。 NO作用短暂，停药后肺动脉压有反弹现象，可能与eNOS失活有关。3.2 米力农与ALI近年来研究发现磷酸二酯酶（Phosphodiesterase,PDE）抑制剂能抑制中性粒细胞与内皮细胞相互黏附，降低肺毛细血管通透性，减轻肺损伤8。米力农为非洋地黄类强心药双吡啶衍生物，属于磷酸二酯酶抑制剂，通过抑制PDE增加了细胞内环磷酸腺苷（cAMP）水平，从而产生增强心肌收缩力、扩张血管降低肺动脉压，还能扩张支气管改善通气功能。米力农应用于ALI的研

31、究尚未见报道。我们结果表明，米力农能显著降低肺动脉压，减少了肺内分流，提高了PaO2，改善了肺通气状况，可能部分与扩张支气管作用有关。同时，米力农增加了内源性NO生成，NO水平显著上升，减少了中性粒细胞在肺内扣押，减轻了肺水肿及蛋白的流失。米力农的抗炎作用可能通过增加中性粒细胞内cAMP水平，减少炎症因子和氧自由基的产生，减少内皮细胞的损伤9，但是否通过内源性NO生成增多产生抗炎作用及与NO的相互作用确切机制还有待进一步研究。MDA水平的降低也间接证明米力农能清除自由基。Levy等10亦发现米力农具有小剂量的米力农具有一定的抗炎作用。米力农还可能通过多种形式减轻ALI，如直接与细胞间活性氧/活

32、性氮相互作用，减少硝酸盐的形成；抑制LPS激发IL-6等炎性因子的生成，促进IL-10等抗炎介质的产生8。病理结果也显示肺泡内炎性细胞显著减少，肺损伤明显减轻，说明米力农具有一定的肺保护作用。王永剑等研究也证实了米力农对离体肺的保护作用11。米力农虽是短效药物，但半衰期要比NO长的多，性质更稳定，能有效降低肺动脉压，对体循环几乎无影响，能增加内源性NO的生成，具有一定的抗炎作用。但长期应用可能会增加死亡率，长期使用应谨慎及有待进一步研究12。3.3 NO与米力农联合应用急性肺损伤患者吸入NO的作用与NO的摄入量有关，吸入NO多分布于通气较好的肺泡，肺通气面积减少会减少NO在肺内的分布而限制NO

33、作用的发挥。Puttensen等13给油酸型ALI狗单纯吸入NO发现对肺氧和改善不明显。在本实验中观察了NO复合米力农治疗ALI的疗效。复合米力农后能进一步降低肺动脉高压，减轻心脏负荷，扩张支气管，改善肺通气功能；同时增加内源性NO的生成，NO水平显著高于其他两治疗组，MDA水平也明显降低，间接证实了清除自由基的能力明显加强；减少白细胞在肺内聚集，抑制中性粒细胞的激活，减少炎性因子的释放，从而减轻内皮细胞损伤，降低毛细血管通透性，避免肺水肿及肺实变的形成，能更好的保护肺脏。我们的结果也证实经治疗后，与其他两治疗组相比，显著提高PaO2、降低肺内分流，更好的改善了肺通气功能。联合应用后抗炎能力也

34、进一步加强，细胞总数特别是PMN百分比显著下降，接近正常。从病理结果看，显微镜下肺泡和肺间质内只见少量的炎性细胞，肺泡间隔无明显增厚，解剖结构接近正常，肺泡扩张良好，说明达到了很好的保护效果。Khazin V等14将NO和米力农联合应用于心脏手术后肺动脉高压患者，发现能更好的降低肺动脉压。我们结果也证实联合应用后能更加显著降低ALI兔的肺动脉高压，且对血流动力学没有明显影响。停止治疗后，肺动脉压没有明显反弹，氧和良好，比单独应用NO或米力农治疗ALI有着更好的疗效且更稳定。多因素方差分析结果表明，NO与米力农之间存在交互作用，两者复合应用后产生协同效应，有着更强的抗炎能力，降低肺动脉高压，改善

35、肺通气功能，抑制ALI。但两者的协同效应是否通过cAMP或内源性NO作用，或其他细胞间信号传导产生作用，还有待进一步的研究。参考文献：1 Waldow T,Alexiou K, Witt K,et al. Affenuation of reperfusion-induced systemic inflammation by preconditioning with nitric oxide in an in situ porcine model of normothermic lung ischemia. Chest, 2004,125(6):2253-59. 2 Rene G, Tames

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37、8(1):85-91.4 Koh Y, Kang JL, Park W, et al . Inhaled nitric oxide down- regulates intrapulmonary nitric oxide production in lipopolysaccharide-induced acute lung injury. Crit Care Med,2001,29(6):1169-74.5 Cuesta EG, Alvarez-Diaz FJ, Renedo AA , et al. Transient response to inhaled nitric oxide in me

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