纤维素酶酶活的测定方法

1、2002年第17期中国饲料27检测分析纤维素酶酶活的测定方法河南省科学院生物研究所刘德海杨玉华安明理河南省饲料产品质量监督检验站陈小鸽饲用纤维素酶在饲料工业中已普及应用,对其质量检测显得日益重要。纤维素酶是一种复合酶,按作用底物的能力划分为两部分,一部分是对棉花纤维素能起催化水解作用的酶,称为C1酶;另一部分是对羧甲基纤维素钠(Na-CMC)起水解作用的酶,称为Cx酶。据此,一般采用两种测定方法,一种是适用于CX酶的CMC法,另一种是适用于C1酶的滤纸法。下面就此两种方法作一介绍。1CMC(羧甲基纤维素)法111材料11111究所提供。11112试剂、柠檬酸、羧甲基纤维素、3,5-二硝基水杨酸

2、、氢氧化钠、酒石酸钾钠、亚硫酸钠、苯酚。11113仪器721型分光光度计、恒温水浴锅、PHS-2酸度计、秒表。11114试剂配制1111411pH510柠檬酸缓冲液制取012mol/L磷酸氢二钠液(称取7116g磷酸氢二钠溶解于蒸馏水中,定容至100mL)和011mol/L的柠檬酸液(称取211g柠檬酸溶解于蒸馏水中,定容至100mL),取磷酸氢二钠液2413mL、柠檬酸液2517mL混匀,用精密酸度计测至pH值为510。1111412羧甲基纤维素溶液准确称取210g羧甲基纤维素钠盐溶于200mL水中,沸水浴中加热至溶化,过滤,取滤液100mL,加柠檬酸缓冲液20mL、蒸馏水40mL,混匀,贮

3、存于冰箱中备用。11114133,5-二硝基水杨酸显色液准确称取613g3,5-二硝基水杨酸置于2mol/L氢氧化钠262mL溶液中,然后加酒石酸钾钠的热溶液(18210g酒石酸钾钠溶于500mL水中),再加510g苯酚和510g亚硫酸钠,搅拌至溶解,冷却后定容至1000mL,贮于棕色瓶中置冰箱中备用。1111414011%标准葡萄糖溶液准确称取经105烘至恒重的无水葡萄糖2501000mg,溶于蒸馏水中,定容至250mL。112标准曲线的绘制分别吸取011%标准葡萄糖溶液210、410、61080mL,分别定容至50mL。215mL于试管,mL,煮沸5min15mL蒸馏水,加215mL3,5

4、,同样煮沸5min)。冷却后,用721型分光光度计在530nm波长下比色,记录各管的光密度值,以光密度作纵座标,对应标准葡萄糖溶液含糖的毫克数为横座标,绘制标准曲线。113测定方法通过“四分法”精确称取酶样品2100g,加温水90mL、柠檬酸缓冲液10mL,40浸提1h,以脱脂棉过滤备用。根据酶活高低,上述酶液需适当稀释使其产生的还原糖在100500g之间,光密度在011016。取1支小试管(15mm×150mm),加羧甲基纤维素钠溶液210mL,于50水浴中预热23min,加稀释酶液015mL,保温30min,取出加入3,5-二硝基水杨酸215mL,沸水浴煮沸5min,冷却后用分光

5、光度计530nm处比色测定OD值。另取小试管加羧甲基纤维素钠210mL,先加入215mL3,5-二硝基水杨酸,再加酶液015mL,其他操作同样品测定作空白测定。114结果计算CMC酶活力=mg/g3050015式中:B从标准曲线中查得的净葡萄糖毫克数(mg);n酶液稀释倍数;015测定时吸取稀释酶液毫升数(mL)。2滤纸法211材料© 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. 28中国饲料2002年第17期21111试剂醋酸钠(AR)、冰醋酸(AR)、甲苯(AR

6、)、氢氧化钠(AR)、酒石酸钾钠(AR)、苯酚(AR)、亚硫酸钠(AR)、3,5-二硝基水杨酸(AR)、新华5号滤纸(剪成1cm×3cm纸条)。21112仪器同CMC法。21113试剂配制2111311011mol/LpH416醋酸醋酸钠缓冲液准确称取醋酸钠(CH3COONa3H2O)6170g和冰醋酸2160mL,以蒸馏水溶解,定容至1000mL。21113123,5-二硝基水杨酸显色液配制同CMC法。212标准曲线绘制同CMC法。213测定方法酶液制备同CMC法。样品测定同样品测定作空白测定。14结果计算滤纸酶活力(FB)=mg/g24h40×15式中:B从标准曲线上查得的净葡萄糖毫克数(mg);n酶液稀释倍数;5mL反5应液中含4mL酶液;1吸取1mL酶解液进行测定。3讨论作为底物的羧甲基纤维素钠,用不同厂家生产的滤纸测定酶活时,结果不尽相同,有时相差还较大。因此,得出酶活力结论时应注明底物产地。,对温度、酸,pH:郑州市花园路28号,邮编:方法为:准确吸取4mL酶液和1mL缓冲液于试管中,加入新华5号滤纸条一条,滴入甲苯23滴防腐,40静止反应24h。吸取滤纸酶解液1mL,加蒸馏水115mL、3,5-二硝基水杨酸溶液215mL于试管中,沸水浴煮沸5min,530