低相对分子质量透明质酸脂质体的制备及透皮性能

1、中国组织工程研究与临床康复 第 15卷 第 3期 2011 01 15出版Journal of Clinical Rehabilitative Tissue Engineering Research January 15, 2011Vol.15, No.3 ISSN 1673-8225 CN 21-1539/R CODEN: ZLKHAH465 1Biological Science and Engineering College, South China University of Technology, Guangzhou 510006, Guangdong Province, China

2、; 2Research Institute of Tsinghua University in Shenzhen, Shenzhen 518057, Guangdong Province, ChinaZhang Wen-qiang , Master, Biological Science and Engineering College, South China University of Technology, Guangzhou 510006, Guangdong Province, China; Research Institute of Tsinghua University in Sh

3、enzhen, Shenzhen 518057, Guangdong Province, ChinaCorrespondence to: Huang Yue-shan, Doctor, Associate professor, Biological Science and Engineering College, South China University of Technology, Guangzhou 510006, Guangdong Province, China Received: 2010-08-07 Accepted: 2010-12-07低相对分子质量透明质酸脂质体的制备及透

4、皮性能 张文强 1,2,黄岳山 1Preparation of low-molecular-weight hyaluronan liposomes and their percutaneous penetration Zhang Wen-qiang1,2, Huang Yue-shan1AbstractBACKGROUND:Hyaluronic acid is a versatile polymer material, in practical applications, due to its large molecular weight,percutaneous absorption eff

5、ect is not satisfied, the use of liposomes as a carrier can improve its transmission effect, with a goodapplication prospect.OBJECTIVE: To study the percutaneous penetration of the liposomes carrying low- molecular-weight hyaluronic acid.METHODS: Low-molecular-weight hyaluronan liposomes were prepar

6、ed through thin films. Orthogonal experiment was design,and percutaneous penetration was study by snake slough.RESULTS AND CONCLUSION: The low-molecular-weight hyaluronan liposomes could enwrap more hyaluronic acid when thetemperature is 35 , the ratio of cholesterol and lecithin is 0.15 1, the rati

7、o of hyaluronic acid and lecithin is 0.03 1, and thepH of hydration medium PBS is 7.5. Hyaluronic acid could penetrate the snake slough more easily when they were enwrapped byliposome, and the percutaneous penetration of hyaluronic acid was improved.Zhang WQ, Huang YS.Preparation of low-molecular-we

8、ight hyaluronan liposomes and their percutaneous penetration. ZhongguoZuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu. 2011;15(3:465-467. 摘要背景 :透明质酸是一种用途广泛的高分子材料 ,在实际应用中 ,由于其相对分子质量较大 ,透皮吸收效果不理想 ,利用脂质体作为其载体可以改善其传输效果 ,具有较好的应用前景目的:观察包裹低相对分子质量透明质酸脂质体的透皮性能。方法 :采用薄膜法制备低相对分子质量透明质酸脂质体 ,设计正交实验 ,采用蛇 蜕研究其透皮吸收性能。结果与

9、结论 :温度 35 、胆固醇与卵磷脂的比例为 0.15 1,透明质酸与卵磷脂 的比例为 0.03 1、水合介质 PBS 的 pH 值为 7.5,可制备包封率较高的低相对分子质量透明质酸脂质体 ; 脂质体包裹低相 对分子质量透明质酸 ,能有效得提高透明质酸透过蛇蜕的能力 ,达到了提高透明质酸透皮吸收率的作用。关键词:低相对分子质量 ;透明质酸;脂质体;透皮吸收 ;包封率张文强, 黄岳山 . 低相对分子质量透明质酸脂质体的制备及透皮性能 J.中国组 织工程研究与临床康复 , 2011, 15(3:465-467. 0 引言透明质酸 ,又名玻璃酸 ,是一种独特的线 性大分子酸性黏多糖 ,由葡萄糖醛酸

10、和 N -乙酰 氨基葡萄糖的双糖单位反复交替连接而成 ,广 泛分布于动物和人体结缔组织 细胞外基质中 , 在眼玻璃体、脐带、皮肤、软骨和滑液中含量 较高。透明质酸为白 色、无定形粉末 ,有吸湿 性,不溶于有机溶剂 ,易溶于水 ,具有良好的 保湿性、润滑 性、黏弹性、非免疫原性和生物 相容性 ,是一种用途广泛的高分子材料 ,在临 床治 疗、诊断和化妆品基质等方面发挥其独特 的作用 1-2 。在实际应用中 ,由于透明质酸相对分子质 量较大 ,不能透过皮肤表面角质层。脂 质体是 磷脂分子亲水头部插入水中 ,疏水尾部伸向空 气,搅动后形成双层脂分子的球 囊,可将药物 包封于类脂质双分子层内而形成的微型

11、泡囊 体 3 。本实验选用适当 低相对分子质量透明质 酸, 制备包裹低相对分子质量透明质酸脂质体 , 并采用正交 实验设计优选透明质酸脂质体的制 备处方 ,考察其对蛇蜕的透皮效果 ,为其应用 提供 一定的实验依据。1 材料和方法设计 :体外观察实验。时间及地点 :于 2009-03/07 在华南理工大 学生物科学与工程学院生物材料实验 室完成。 材料:低相对分子质量透明质酸 （自制 ; 透 明质酸酶 （Alfa Aesar 公司 ; 大 豆卵磷脂 （上海源 聚生物科技有限公司 ; 胆固醇 （上海伯奥生物科 技有限公司 ;磷酸 盐缓冲溶液 （PBS,自配 ; 药物透皮扩散试验仪 （上海优浦科学仪

12、器有限 公司 ;紫外- 可见光谱仪 （美国热电公司 。张文强,等 . 低相对分子质量透明质酸脂质体的制备及透皮性能P .O. Box 1200, Shenyang 110004 466www.CRTER .org1华南理工大学生 物 科学与 工程学 院, 广东省广州市 510061; 2深圳清 华大学 研究院, 广 东 省 深 圳 市 518057张文强 , 男, 1985年生,陕西 省大荔 县人 ,汉族, 硕士, 主要从 事生物 医用材 料 研究。yywenzi23 通讯作 者:黄岳 山, 博士, 副教授, 华南理 工大 学生 物科学 与工 程学 院, 广东 省广州市 510061中图分类号

13、 :R318 文献标识码 :B文章编号 :1673-8225 (201103-00465-03收稿日期:2010-08-07 修回日期 :2010-12-07 (20090807002/M?Y实验方法 :脂质体的制备 :称取一定量卵磷脂、 胆固醇 ,溶解于体积比为 2 1的乙醚 /甲醇混合溶剂 50 mL中, 与适量低相对分子质量 透明质酸水溶 液一起加入梨形烧瓶中 , 于 40 恒温水浴中减 压旋转蒸发除去有机 溶剂 ,使卵磷脂等成膜材 料在烧瓶壁上形成均匀的薄膜。然后往烧瓶中 加入 PBS 溶液 15 mL, 旋转洗膜即得柔性脂质体 粗制混悬液。将制得的柔性脂质体粗制混悬 液 在冰水浴超声

14、混合 30 min 后, 过 0.50 m微孔滤 膜 ,即得到脂质体混悬液。包封率的 测定 :精密称取 脂质 体混悬液 0.5 mL, 用 PBS 稀释 3倍 后上 柱 , 采 用 SephadexG-50凝胶柱, 用 PBS 洗脱, 控制流速 1 mL/min,收集游离透明质 酸,水解,用紫外 分光光度法测定葡萄糖醛酸含量 (550 nm,换 算成透明质酸浓度。另 外再取 0.5 mL脂质体混 悬液,加入体积比为 2 1的乙醚 /甲醇混合溶剂 将其溶解, 提取透明质酸 ,按上述方法测得透 明质酸总量。包封率根据下式计算 :包封率 (%=(m 总 -m 游 /m 总 ×100%。式中

15、 m 总 、 m 游 分别表 示脂质体混悬液中总的透明质酸 的质量和游离 的透明质酸的质量。体外透皮扩散试验 :自购蛇蜕 ,浸泡于生理盐水中 30 min后,保存于 4 PBS溶液中 12 h后备用。剪取合适大小皮肤块固 定于药物透皮 扩散试验仪 (扩散面积为 1.0 cm2, 接受池容积为 8.5 cm3中, 蛇蜕外表面面向供给室。 接受池为 PBS 缓冲溶液。温度为 37 ,搅拌,于 固定时 间取样 0.5 mL,取样后同时补入等量接受液。 实验结束后将所取的样品溶液 适当稀释后过 0.50 m微孔滤膜,水解,用紫外分光光度法测 定 550 nm处吸光度 4-5。主要观察指标 :脂质体的包

16、封率、透皮性设计、实施、评估者 :实验设计为第一、 二作者 ,实施为第一作者。2 结果与讨论2.1 脂质体的制备 考虑到众多因素对脂质 体成囊及质量的影响 ,本研究采用正 交设计 法,根据文献资料和预实验的结果 ,确定了以 影响透明质酸脂质体包封率为指 标的 4个因 素,分别为旋转蒸发温度、胆固醇与卵磷脂的 比例 (CH PC 、透明质 酸与卵磷脂的比例 (HA PC 、水合介质 PBS 的 pH 值,每个因素选 3 个水平 , 见表 1, 2 。结果表明 ,在本试验方案所取的因素和水 平下,最佳处理工艺组合为 A3B3C2D3, 各因 素的重要指标程度依 次为 A> C> B&g

17、t; D。即温度 35 、 CH PC 为 0.15 1, HA PC 为 0.03 1、 pH7.5。可以看出 ,最佳处理工艺在 9次试验中 没有 出现 , 与第 9号试验 A3B3C2D1比较接近 , 而 pH 值对包封率的影响 是最小的, 从实际做出 的结果 看出 第 9号试验 是 33.73%, 是 9次试验中最 高的, 说明最 好 方案 是符 合实 际 的。目前制备脂质体的方法 颇多, 常用的有薄 膜法、 逆相蒸发法、 复乳法、 熔 融 法、 注 入法、 冷冻干燥 法、离 心 法等。薄膜法 是 最 早而至今 仍常 用的方法 , 主 要用于制备大 单 室脂质体 , 可 制备 粒径 50

18、05 000 nm 的脂质体3,62.2 优选处方的验证实验 按照优选处方的 配比制备 3批低相对分子质量透明 质酸脂质体 , 测得平均包封率为 (35.08 0±.52%。2.3 体外透皮扩散实验 透皮扩散实验分 3组:脂质体组为自制的透明质酸脂质体 液 2 mL, 对 照组为相同浓度低相对分子质量透明质酸的 PBS 溶液 2 mL, 空白 组为 PBS 液 2 mL。接受液张文强,等 . 低相对分子质量透明质酸脂质体的制备及透皮性能ISSN 1673-8225 CN 21-1539/R CODEN: ZLKHAH467www. CRTER .org不 同透皮时间的吸光度见表 3

19、。由表 3中 可见, 相同透皮时间下脂质体组吸光度明 显高 于对 照组, 说明相 同透皮时间下脂质体组透明质酸透 过率明 显高 于对 照 组,提示采用脂质体包 裹 低 相对分子 质量透明质酸 , 能有 效得提 高透明质酸透过蛇蜕的能 力 , 达到了提 高 透明质酸透皮吸收率的作用。 空白 组也会 在紫外 550 nm波长处产生吸收, 这种 吸收 可 能是皮肤 渗出 物产生的,在计算 累积透过量时 应去除皮肤 渗出 物的影 响 7目前 有 很多脂质体 促进 药物透皮吸收的 报道 。以脂 质体作为 载 体的药物 或 其 他功效 成分 易进 入 角 质 层 ,在表皮和 真皮 内形成药物 储库 ,药物

20、 可持续 发 挥功效 , 现 已 成为皮肤 病 药物 治疗 和 化妆 品的研究 热点 。脂质体 可 促进 药物透皮吸收 ,其机制 主要有: 脂质体的 类 脂与 角 质层 的脂质相 互 作用, 增 加皮肤脂质的流 动 性, 从而 促进 药物的透过。 融 合机制。脂质体磷脂与 角 质 层 脂 质融 合使 角 质 层 组成和结 构改变 ,形成一 种扁 平的 颗粒 结 构 , 通 过脂质 颗粒 间 隙 ,脂质体包封的药物 便 于 进 入皮肤, 经由 脂质交换、 融 合作用, 维护 皮肤生理 功 能。 脂质体 可 使 角 质 层湿润 ,水合作用加 强 ,使 角 质 细胞间的结 构改变8-93 结论控制温

21、度 35 、 CH PC 为 0.15 1, HA PC 为 0.03 1、 pH 7.5, 可制 备包封率 较高 的低相对分子质量 透明质酸脂质体 ; 采用脂质体包 裹 低相对分子 质量透明 质酸,能有 效 提 高 透明质酸透过蛇蜕的能 力 , 达 到了提 高 透明质酸透 皮吸收率的作用。本研究 可 为透明质酸在 医 药和 化妆 品中的 应 用研究提供一定 的实验依据。4 参考文献 1 Nelson JD, Farris RL. Sodium hyaluronate and polyvinyl alcohol artificial tear preparations. A compariso

22、n in patients withkeratoconjunctivitis sicca. Arch Ophthalmol. 1988;106(4:484-487. 2Zhang WQ,Huang YS,Zhi XX.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu LinchuangKangfu. 2008;12(23:4515-4518.张文强 , 黄岳山 , 支晓兴 . 透明质酸在临床医学中的应用 J.中国组织工程 研 究与临床康复 ,2008,12(23:4515-4518.3 Zhang W,Yan CE.Huaxue Jinzhan. 2006;18(12:1684-1690.张伟 , 闫翠娥 . 透明质酸及其衍生物药物载体 J.化学进展 ,2006, 18(12: 16841690.4 Cai S, Liu Y, Zheng Shu X,et al. Injectable glycosaminoglycan hydrogels for controlled release of human basic fibroblast growth factor. Bio