高效液相色谱仪维护规程

1、1目的建立本实验室高效液相色谱仪的保养维护操作，确保仪 器能正常使用。2适用范围适用于本实验室高效液相色谱仪的保养维护操作。3责任者本实验室所有操作高效液相色谱仪人员。4操作规程高效液相色谱法系采用高压输液泵将规定的流动相泵入 装有填充剂的色谱柱，对供试品进行分离测定的色谱方法。 注入的供试品，由流动相带入柱内，各组分在柱内被分离， 并依次进入检测器，由积分仪或数据处理系统记录和处理色 谱信号。4.1对仪器的一般要求和色谱条件所用的仪器为高效液相色谱仪。仪器应定期检定并符合有 关规定。4. 1. 1色谱柱反相色谱系统使用非极性填充剂，常用的色谱柱填充剂 为化学键合硅胶，以十八烷基硅烷键合硅胶最

2、为常用，辛基 硅烷键合硅胶和其他类型的硅烷键合硅胶（如氯基键合硅烷 和氨基键合硅烷相等）也有使用。正相色谱系统使用极性填 充剂，常用的填充剂有硅胶等。离子交换色谱系统使用离子 交换填充剂；分子排阻色谱系统使用凝胶或高分子多孔微球 等填充剂；对映异构体的分离通常使用手性填充剂。填充剂的性能（如载体的形状、粒径、孔径、表面积、 键合基团的表面痕盖度、含炭量和键合类型等）以及色谱柱 的填充，直接影响供试品的保留行为和分离效果。分析分子 量小于2000的化合物应选择孔径在15nm （1nm=10A）以下 的填料，分析分子量大于2000的化合物则应选择孔径在 30nm以上的填料。除另有规定外，普通分析柱

3、的填充剂粒 径一般在31 Oum之间。粒径更小（约2um）的填充剂常用 于填装微径柱（内径约2mm）o使用微径柱时，输液泵的性能、进样体积、检测池体积和系 统的死体积等必须与之匹配；如有必要，色谱条件也需作适 当的调整。当对其测定结果产生争议时，应以品种项下规定 的色谱条件的测定结果为准。以硅胶为载体的键合固定相 的使用温度通常不超过40°C,为改善分离效果可适当提高 色谱柱的使用温度，但不宜超过60°C。流动相的PH值应控制在2飞的。当PH大于8时，可使载体 硅胶溶解；当PH小于2时，与硅胶相连的化学键合相易水 解脱落。当色谱系统中需使用PH值大于8的流动相时，应GAGG

4、AGAGGAFFFFAFAF选用耐碱的填充剂，如采用高纯硅胶为载体并具有高表面覆 盖度的键合硅胶填充剂、包裹聚合物填充剂、有机-无机杂 化填充剂或非硅胶基键合填充剂等；当需使用PH值小于2 的流动相时，应选用耐酸的填充剂，如具有大体积侧链能产 生空间位阻保护作用的二异丙基或二异丁基取代十八烷基 硅烷键合硅胶填充剂、有机-无机杂化填充剂等。4. 1.2检测器 最常用的检测器为紫外检测器，包括二极 管阵列检测器、其他常见的检测器有荧光检测器、示差折光 检测器、蒸发光散射检测器、电化学检测器和质谱检测器等。 紫外、荧光、电化学检测器为选择性检测器，其响应值不仅 与供试品溶液的浓度有关，还与化合物的结

5、构有关；示差折 光检测器和蒸发光散射检测器为通用型检测器，对所有的化 合物均有响应；蒸发光散检测器对结构类似的化合物，其响 应值几乎仅与供试品的质量有关；二极管阵列检测器可以同 时记录供试品的吸收光谱，故可用于供试品的光谱鉴定和色 谱峰的纯度检查。紫外、荧光、电化学和示差折光检测器的响应值与供试品溶 液的浓度在一定范围内呈线性关系，但蒸发光散射检测器响 应值与供试品溶液的浓度通常呈指数关系，故进行计算时， 一般需经对数转换。不同的检测器，对流动相的要求不同。 如采用紫外检测器，所用流动相应符合紫外一可见分光光度 法（附录V A）项下对溶剂的要求；采用低波长检测时，还 应考虑有机相中有机溶剂的截

6、止使用波长，并选用色谱级有 机溶剂。蒸发光散射检测器和质谱检测器通常不允许使用含 不挥发盐组分的流动相。4. 1.3流动相 反相色谱系统的流动相首选甲醇-水系统（采用紫外末端波长检测时，首选乙睛-水系统），如经试用 不适合时，再选用其他溶剂系统。应尽可能少用含有缓冲液 的流动相，必须使用时，应尽可能少用含有缓冲液的流动相， 必须使用时，应尽可能选用含较低浓度缓冲液的流动相。由 于C18链在水相环境中不易保持伸展状态，故对于十八烷基 硅烷键合硅胶为固定相的反相色谱系统，流动相中有机溶剂 的比例通常应不低于5%,否则C18链的随机卷曲将导致组分保留值变化，造成色谱系统不稳定。各品种项下规定的条件除

7、固定相种类、流动相组分、检测器类型不得改变外，其余如色谱柱内径、长度、载体粒度、流动相流速、混合流动相各组分的比例、柱温、进样量、 检测器的灵敏度等，均可适当改变，以适应供试品并达到系 统适用性试验的要求。其中，调整流动相组分比例时，以组 分比例较低者（小于或等于50%）相对于自身的改变量不超 过±30%且相对于总量的改变量不超过±10%为限，如30%相 对改变量的数值超过总量的10%时，则改变量以总量的±10% 为限。对于必须用特定牌号的填充剂方能满足分离要求的品种，可 在该品种项下注明。5. 液相色谱仪使用注意事项5. 1.流动相必须用HPLC级的试剂，使用前

8、过滤除去其中的 颗粒性杂质和其他物质（使用0. 45um或更细的膜过滤）o5.2. 流动相过滤后要用超声波脱气，脱气后应该恢复到室温 后使用。5.3. 不能用纯乙睛作为流动相，这样会使单向阀粘住而导致 泵不进液。5. 4.使用缓冲溶液时，做完样品后应立即用去离子水冲洗管 路及柱子一小时，然 后用甲醇（或甲醇水溶液）冲洗40分钟 以上，以充分洗去离子。对于柱塞杆外部，做完样品后也必 须用去离子水冲洗20ml以上。5. 5.长时间不用仪器，应该将柱子取下用堵头封好保存，注 意不能用纯水保存柱子，而应该用有机相（如甲醇等），因为 纯水易长霉。5. 6.每次做完样品后应该用溶解样品的溶剂清洗进样器。5

9、.7. C18柱绝对不能进蛋白样品，血样、生物样品。5.8.堵塞导致压力太大，按预柱T混合器中的过滤器T管路 过滤器T单向阀检查并清洗。清洗方法；以异丙醇作溶剂 冲洗：放在异丙醇中间用超声波清洗；用10%稀硝酸清洗。5. 9.气泡会致使压力不稳，重现性差，所以在使用过程中要 尽量避免产生气泡。5. 10.如果进液管内不进液体时，要使 用注射器吸液：通常在输液前要进行流动相的清洗。5. 11.要注意柱子的pH值范围，不得注射强酸强碱的样品， 特别是碱性样品。5. 12.更换流动相时应该先将吸滤头部分放入烧杯中边振动 边靖洗，然后插入新的流动相中。更换无互溶性的流动相时 要用异丙醇过渡一下。5.1

10、3: 一定打开排液阀，再排空，否则很容易把色谱柱冲 塌陷。5. 14如果流动相中含有酸，用10%的甲醇（乙睛）水溶液 冲洗系统40"60min,然后再用100%甲醇冲洗系统10min, 保证所有管路都在100%甲醇溶液中。5. 15如果流动相中含有离子对或缓冲盐，用10%的甲醇（乙 睛）水溶液冲洗系统6090min,然后再用100%甲醇冲洗系 统10min,保证所有管路都在100%甲醇溶液中。5. 16如果管路长时间不用，请用100%甲醇把管路冲洗干净, 以免管路发霉、长菌、腐败。5. 17经常将2个管路相互使用不同的流动相。5. 18如果仪器可以连续使用，不必关机，如果超过48h以 上，就可以考虑关机，节约氛灯寿命。6、液相维护6.1. 管路过滤器的检查及清洗，吸滤头及在线过滤器先用 异丙醇超声515min,然后用甲醇超声515min,随后用双 蒸水超声515min,再用甲醇清洗超声515min,安装。6.2. 液相