第五章 神经营养因子

1、第五章  神经营养因子第一节  神经营养因子的生物学基础一、神经营养因子的发现与发展历史1、定义一般将神经营养物质(neurotrophins)和对神经细胞存活具有调节作用的生长因子统称为神经营养因子(neurotrophic factors, NTFs)。2、发现与发展历史50年前神经生长因子(nerve growth factor，NGF)的发现开辟了肽类生长因子的纪元。具有神经元特异性的NGF成为第一个被发现的细胞生长因子，也是最典型的神经营养因子。二十世纪五十年代初，Levi-Montalcini利用鸡胚背根节组织培养技术建立了检测该活性分子生物活性的经典方法(图5

2、-1)。不久她又和Cohen一起相继找到了两种富含这种物质的生物材料蛇毒和小鼠颌下腺。1959和1960年先后从中分离纯化出这种促神经生长的、可溶性蛋白质，之后命名为神经生长因子(NGF)。NGF的发现使人们认识到，在神经系统的发生过程中，需要一些能促进神经元发育、生长和维持其活性的因子，由此开辟了神经生物学的新领域，Levi-Montalcini和Cohen也因此获得了1986年度诺贝尔生理学奖。                  

3、图1神经生长因子(NGF)的神经营养活性 左侧未加NGF的鸡胚背根节，右侧加入NGF的鸡胚背根节，可观察到NGF的促进突起生长的作用。由于NGF只选择性地对几类神经细胞有作用，人们推测还有其它类型的神经营养因子存在。近二十年来又陆续发现九种新的神经营养因子。1982年Barde等从脑中分离到脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor, BDNF)。1989年，BDNF的基因被克隆。1990年，根据BDNF和NGF中保守性最强部分的序列，利用PCR等技术，几个实验室几乎同时发现了NGF基因家族的第三个成员，如脑源性神经营养因子(brain-derive

4、d neurotrophic factor)、神经营养素-3(neurotrophin-3 NT-3)、神经营养物质4/5(neurotrophin-45，NT45)、神经营养素-6(neurotrophin-6，NT-6)、睫状神经营养因子(ciliary neurotrophic factor，CNTF)和胶质细胞源性神营养因子(glia cell line-derived neurotrophic factor，GDNF)。由于它们的氨基酸序列相似，因此统称为NGF家族或神经营养因子(neurotrophic factors，NTFs)”。   二、神经营养因子的分子

5、特点神经营养因子主要包括NGF，BDNF，NT-3，NT-4/5等。作为同一家族的成员，它们的基因结构十分相似，都起源于同一基因家族。图  5-2 大鼠NGF，BDNF，NT-3氨基酸序列及可变区（方框内）从测序后推导的氨基酸序列来看，它们都有较大的前体，它们成熟活性多肽的氨基酸序列分为保守区和可变区，这些区域可能与它们的功能有关。它们的活性形式均为二聚体，氨基酸序列同源性大于50%(图5-2)。它们成熟活生多肽的等电点均大于9.0，人NGF，BDNF，NT-3和NT-4/5分别由120，119，119和130个氨基酸组成(表5-1)。 表5-1  神经营养因子的

6、理化性质 等电点前体氨基酸数活性蛋白氨基酸数分子量(kDa)N-端糖基化位点二硫键数NGF(人)102411202633NGF(小鼠)102413703131182633BDNF(人)9. 992471192703BDNF(小鼠)9. 992491192703NT-3(人)9. 52571192703NT-3(小鼠)9. 52581192703NT-4(人) 2101301403NT-4(小鼠) 2091301403 第 二 节  神经营养因子受体一、神经营养因子受体的种类NTs通过与两种类型细胞表面受体，即TrK酪氨酸激酶和p75NT受体(p

7、75NTR)相结合来调控神经元的活存、分化、生长和凋亡。这些受体通常共存于同一细胞上，调节神经元对NTs的反应。NT受体的功能从发育的神经系统可塑性到损伤神经元的活存和再生极为重要。Trk受体介导正向信号如促进生长和活存，p75NTR则介导正向和反向信号。两类受体发出的信号相互间或一致或对立。NT信号转导的关键问题是两种NT受体在一起如何调节细胞对NTs的反应以及这些受体在行使其作用时所采用的胞内信号的性质。近年来，促进NT作用的一些新的受体胞内信号蛋白及信号转导途径已被确认。1、Trk受体及其作用Trk即原肌球蛋白受体激酶(tropomyosin receptor kinase)，是原癌基因

8、trk的产物，由原肌球蛋白和酪氨酸激酶融合产生，分子量为120160kD的单跨膜糖蛋白，是受体酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinase，RTK)家族中的成员，该家族有相类似的结构，由胞外一个大的糖基化的配体结合区、跨膜区(TM)、胞内区(可分为近膜区、酪氨酸激酶区、羧基尾区)组成，其中胞外区含亮氨酸富集结构(leucine rich motif，LRM)和免疫球蛋白区(IgG区)。两个位于LRM旁侧的半胱氨酸簇，将Trk同酪氨酸激酶家族的其它成员相区别；而LRM决定了与配体结合的特异性。Trk受体分为TrkA(分子量140kD)、TrkB(145kD)和TrkC(145kD

9、)，其相应的配基分别为NGF、BDNF和NT-3，TrkB的另一个配基为NT45，NT-3也可作用于TrkA和 TrkB。NTs家族成员主要通过Trk受体的自身磷酸化进行信号转导，产生效应；该类受体与NTs结合后缓慢释放，其解离常数为10-1molL，故又称为高亲和力受体(图5-3)。             图 5-3  神经营养因子受体及其功能p75NT受体(p75NTR)  在NTs受体中还有一个分子量为75kD(p75NTR)的低亲和力受体，它能与所有的NTs以相似的

10、亲和力结合(NT-6尚不明确)，解离常数为 10-9molL，是富含半胱氨酸的图5-4 NGF与 p75NT受体的结合糖蛋白 (图5-4)。图5-4二、神经营养因子的生物活性1、发育期（1）促进神经元活存、生长和分化成熟的作用：神经元进入成熟阶段的标志包括突起的充分发育和突触形成，神经元特异递质合成酶的表达，以及膜离子通道和膜电位的出现。NTFs对发育中神经元在上述形态学和生物化学等方面指标有促进作用。NGF对外周交感神经元、背根节感觉神经元和中枢胆碱能神经元从发育到成熟的过程具有生理作用。（2）对神经递质选择的作用：在神经元分化初期，其递质属性尚未确定，在发育过程中必然经历递质选择。递质选择

11、主要取决于从细胞迁移至最终定位所经历的环境因素。例如，成熟交感神经节中的大多数是去甲肾上腺能神经元，也有少量支配汗腺的胆碱能神经元。NGF是促进交感神经元内去甲肾上腺素酶系发育的主要生长因子。而那些胆碱能神经元在交感节发育早期也都经历过去甲肾上腺能阶段才最终成为胆碱能表型，即经历过递质的选择和转换。（3）诱导神经纤维定向生长：从体外培养观察到，鸡胚或鼠胚背根节和长出的突起向分泌NGF的小鼠颌下腺生长，而不向缺乏NGF的舌下腺生长。在体内，NGF是诱导神经纤维长向靶区的重要因素之一。（4）控制神经元存活数量：发育过程中有一个神经元自然死亡的减数现象，出现在神经轴突长人靶区后不久。NGF效应神经元

12、的自然减数是通过靶区NGF水平来控制的。实验观察到，分散培养的发育期效应神经元依赖NGF存活；效应神经元的自然减数在时间上与靶区NGF水平的下降相一致。2、成年期进入成年期，NTs及其受体的表达和分布都明显减少，效应神经元对NTs的依赖也明显降低，只有部分交感神经元仍需依赖NGF存活。一些外周和中枢的神经元仍需要一定水平的NTs维持其正常功能。3、损伤修复期神经损伤包括外伤、疾病、中毒、老化等因素造成的中枢和外周神经系统的损伤，是临床医学至今难以解决的问题。成熟神经元和神经系统仍保留一定程度的再生修复能力是建立在神经元可塑性(neuronal plasticity)的基础之上。就单个神经元而言

13、，可塑性使它在非致死性伤害后有发生改变与适应的能力；而就神经系统而言，则可利用活存的神经元，代偿死亡神经元的部分功能，从而减轻损伤的后果。4、NTFs的基因敲除动物模型NTFs及其受体基因敲除(knockout)动物模型的建立，有助于在分子水平上了解NTFs及其受体的功能，以及它们在神经系统发育过程中的地位和作用。NTs及其受体的基因敲除转基因动物表型见表5-2。 表5-2  NTs及其受体基因敲除Kn小鼠的表型缺失基因表        型trkA致死性的，生后1个月内死亡，感觉及交感神经元缺失trkB致

14、死性的，生后即死亡，面神经核和脊髓运动神经元缺失，三叉神经节、背根节缺失trkC致死性的，生后1个月内死亡，本体感觉缺失，运动姿势异常p75NTR非致死性的，可存活至成年，但感觉神经元的一个亚群丢失，周围感觉和交感神经分布缺陷ngf非致死性的，但出生后，体中增加停止、长疮、出现自毁颂向，感觉和交感神经细胞缺失bdnf致死性的，感觉神经缺陷，颅神经节、外周神经节缺失，最严重的是前庭神经节细胞显著丧失，因此其形维表现为旋转、共济失调和呈弓状姿势nt-3致死性的，感觉和交感神经元丧失，脊髓传入纤维数目下降，与传递本体感觉有关的感受器(肌梭和Golgi腱器)nt-45正常，10个月内无明显的神经元和表

15、型异常bdnf+at-45致死性的，与单纯BDNF缺陷相似 从上表看。NTs及其受体基因缺失，将会严重影响神经系统的发育，甚至发生个体的死亡。NTs的基因敲除动物模型在PNS中表现为特异的靶神经元缺失，不同的NTs支持相应的特异性神经元群；在CNS中基因敲除的靶神经元缺失不明显，NTs的作用以调节功能为主。NTs及其Trk受体成员之间，甚至相应的配基与受体之间的基因缺失可导致不同的表型。TrkA、TrkB、TrkC、BDNF和NT-3的基因缺失均为致死性的，说明这些NTs和受体在神经系统发育中有更重要的作用，而NGF的作用可能通过NT-3作用于TrkA来实现；NT-45的作用可被BD

16、NF作用于TrkB所代偿。但TrkA、TrkB和TrkC的作用是必须的，其作用无法替代，作为受体激动剂的BDNF和NT-3同样不可缺少。而p75NTB仅在外周感觉和交感神经活动中起部分作用，不是神经活动所必须的。第 三 节  神经营养因子的临床应用前景NTFs从研究初期就预示了临床应用的可能性，正是在这种前景的引导下，才有目的地进行了动物模型实验。这些实验的确像预期的那样表明NTFs对某些神经损伤和疾病有着以前疗法所未达到的疗效。由于基因工程药的发展，能获得大量NTFs用于临床试验，但由于NTFs均为蛋白质，不易通过血脑屏障，故目前临床试验主要在脊髓或PNS疾病上进行，对CNS相关的

17、疾病仍以动物模型研究为主。一、NTFs与神经系统疾病神经系统疾病主要包括神经退行性疾病(neurodegenerative diseases)和神经损伤等。神经退行性疾病如帕金森病(Parkinsons disease，PD)、阿尔茨海默病(Alzheimers disease，AD)、肌萎缩性脊髓侧索硬化(amyotrophic lateral aclerosis，ALS)等，目前多无有效治疗手段。大量体内体外研究表明，NTFs在神经系统疾病的诊断和治疗中具有临床应用价值，见表5-3。1、运动神经元疾病ALS是一种致死性运动神经元退行性疾病，常用药物有抗痉挛剂Baclofen，抗抽搐的Quh

18、ine Sulfate phenytoin、Car bame zepine，抗抑郁剂三环类等。目前尚无有效治疗措施。体内体外研究表明，发育及成熟运动神经元对BDNF、NT-3、NT45有反应，BDNF、NT-3增加培养的胚胎大鼠运动神经元的活性，BDNF可防止运动神经元的自然死亡，并对损伤的新生大鼠面部运动神经元有保护作用；当神经切断后，BDNF、NT-3逆行运输到运动神经元急剧增加，外源性BDNF能延迟自然发生MND(motor neuron disease)中的运动失调，减轻神经肌肉萎缩和运动轴突消失，这些研究为应用BDNF治疗ALS提供了理论基础。目前，BDNF已进入治疗ALS的临床试验

19、阶段。 表5-3  神经营养因子的选择活性及临床应用可能疾  病作 用 部 位NGFBDNFNT-3NT-45CNTFGDNF外周神经病感觉神经元  交感神经元     ALS运动神经元 AD基底前脑胆碱能神经元 皮层神经元   海马神经元   PD多巴胺能神经元    HD纹状体神经元    局部缺血皮层神经元  &

20、#160;  急性脑脊髓损伤皮层脊髓神经元     2、帕金森病PD它是由于黑质纹状体多巴胺能神经元的进行性退化而引起的运动失调症。其神经元退化进程远在临床症状出现之前。目前常用的药物有DA的前体左旋多巴(EDOPA)及多巴胺(DA)受体激动剂。这些药物副作用大，并不能改变神经元退化。由于BDNF对多巴胺神经元的特殊营养作用，并对DA能神经元选择性毒性物质6-OHDA和MPP+损伤的神经元有保护作用。大量的体内体外实验研究表明BDNF有望用于PD的治疗。    GDNF是目前发现对DA能神经元作

21、用最强的因子之一，在PD动物模型中，单次脑内注射100和450g GDNF，能扭转DA能神经元变性，且不会出现运动障碍，效果好于L-多巴。尽管GDNF效应较强，但其作用范围较广，对多种神经元有作用，故在临床应用上，需考虑GDNF可能产生的多种作用。3、早老性痴呆(AD)AD的病理变化为广泛的大脑皮层神经元丧失，尤其是海马和基底前脑胆碱能神经元退化。临床常用药物有胆碱酯酶抑制剂多奈哌齐等能够提高患者认知功能。有恶心、腹泻、失眠等不良反应外，并不能减慢神经元的退化。NGF能防止前脑胆碱能神经元的萎缩，提高出现认知损伤的老年大鼠的胆碱乙酰转移酶ChAT水平，增加存活胆碱能神经元的功能，提高记忆。这些

22、现象为NCF用于AD治疗提供了理论基础。神经营养素因子家族其他成员如BDNF、NT-3、NT45均能维持胆碱能神经元存活，上调其ChAT表达，且有比维持神经元存活更为广泛的作用，这些广泛作用与AD尤其有关的胆碱能神经元也有营养作用，能扭转运动活性下降，改善运动失调。多种神经营养因子的联用可能产生最佳效果。目前，用损毁大鼠基底前脑胆碱能投射系统复制AD症状，但并不能完全模拟AD病人的所有病症，因此尚需建立更为合适的动物模型。4、外周感觉神经病外周感觉神经元退化是外周神经病的常见病症，往往由糖尿病、抗癌药(如顺铂)、酒精中毒、艾滋病(AIDS)、遗传因素等引发。NGF用于外周感觉神经病的临床试验已

23、经开始，长期治疗可延缓感觉功能减弱并能使部分丧失的功能恢复。    除上述疾病以外，BDNF、NT-3、NT45对听神经损伤、视神经损伤也有保护作用， NTs在神经胶质瘤、成神经细胞瘤等疾病治疗中也有应用前景。5、急性神经系统损伤和脑缺血机械损伤或脑缺血引起的急性神经系统损伤目前尚无有效的药物治疗。NGF脑室注射可抑制沙土鼠脑缺血后引起的海马神经元死亡；BDNF和NT45则可明显减少因结扎大鼠大脑中动脉而引起的梗死面积；动物实验表明NTFs可减少因缺血中风引起的神经元变性，并改善症状；BDNF、NT-3和NT-45均能增加皮质神经元对葡萄糖和氧的利用二、神经营养因

24、子的临床应用策略    由于神经营养因子难以通过血脑屏障，故不能直接通过全身给药治疗中枢疾病，因而关于神经营养素的给药方式和提高其利用效率显得尤为重要。1、脑内给药方式(1)            用机械微泵装置将NTFs盲接注入脑内。如hrNGF脑室给药可作为NGF治疗 AD的有效给药方式；(2)            将活性蛋白因子包裹式制备脂

25、质体或微囊化后植入脑内，可作为体内一种有效的释放系统治疗中枢神经系统疾病。(3)            利用脑移植手段，如以胚胎黑质或自体，肾上腺髓质嗜铬细胞为供体治疗PD，移植后注入NGFs可提高移植物的存活率，并可增强治疗作用。(4)            通过细胞移植将有持续分泌神经营养因子活性的遗传修饰细胞植入脑内。一是直接移植分泌NTFs的工程细胞，二是将遗传修饰细胞

26、微囊化后移入脑内。(5)            直接将神经营养因子基因导人CNS细胞内以增加神经营养因子的表达水平。2、利用蛋白修饰手段增加神经营养因子通过血脑屏障的能力有人将BDNF与能穿越血脑屏障的载体(如NLA-OX26)结合形成载体介导肽药，穿过血脑屏障而运送人脑发挥其特殊的生物作用。3、改造基因序列利用基因工程手段增加因子的功能，扩大因子的应用范围  将 NGF、BDNF、NT-3的活性结构域组人到NT-3基因主架中，表达名为PNT-1的合成营养因子，它能与Trk受体及p75NTR结合，其神经营养作用与三种因子联用相当，注入坐骨神经后显示很强的逆行运输到DRG神经元的能力。这一结果表明PNT-1是强有力的、