荧光光度法测定血卟啉在荷瘤小鼠体内的分布

1、西北大学学报 (自然科学版 2005年 8月 , 第 35卷第 4期 , Aug . , 2005, Vol . 35, No . 4Journal of North west University (Natural Science Editi on 收稿日期 :200321229 基金项目 :国家自然科学基金资助项目 (39870240; 30270383 ; 陕西师范大学研究生培养创新基金资助项目 作者简介 :汤 薇 (19812 , 女 , 陕西西安人 , 陕西师范大学硕士生 , 从事生物医学超声研究 。荧光光度法测定血卟啉在荷瘤小鼠体内的分布汤 薇 , 刘全宏 , 刘书瑗(陕西师范大学

2、 生命科学学院 , 陕西 西安 710062摘要 :目的 通过测定血卟啉 (HpD 在荷瘤小鼠体内的分布 , 为声动力疗法处理不同部位肿瘤的 时间点提供依据 。 方法 利用荧光分光光度计测定组织提取液中血卟啉的荧光强度 , 根据标准曲线计算其在组织中的含量 。 结果 肿瘤组织中 HpD 的含量低于肝 、 肾组织而高于皮肤 、 肌肉 。与 其他组织相比 , 肿瘤组织中 HpD 代谢速度最缓慢 , 说明其对 HpD 的潴留能力 根据各组织 内的不同代谢情况 , 提出不同部位的肿瘤 , , 认为声动力疗 法抗肿瘤处理的时间点应选择在 2472h 之间 。关 键 词 :荧光光度法 ; 血卟啉 ; S1

3、80; 中图分类号 :Q274 文献标识码 : (2005 0420436204 日本学者 Ume (Sonodyna m ic , 即利用超声激 胞内 的血卟 啉 (HpD 杀伤癌细胞的方法 1。由于该方法对于治 疗肿瘤细胞有较强的针对性以及对正常组织的无创 伤性 , 所以对于治疗肿瘤 , 特别是组织深层肿瘤有着 较好的应用前景2。由于 HpD 是受超声激活后产生对癌细胞的杀 伤作用 , 所以 HpD 在组织内的浓度变化是恰当选择 超声处理时间点的重要依据 , 它直接关系到治疗肿 瘤的有效性 。 国内外学者在进行此方面研究时曾利 用同位素标记 HpD 来追踪代谢过程 3, 4, 虽然准确性高

4、 , 但同位素实验标记复杂 、 易受半衰期影响 、 耗资较多且对人体不安全 。HpD 作为一种光敏剂 , 受一定波长的光激发后会产生红色荧光 , 而且在一定范围内荧光强度与 HpD 浓度成正线性关系 , 所以可采用荧光光度法检测肿瘤组织内光敏剂含量 。但是 , 目前用此法测定 荷瘤小鼠体内 HpD 代谢状况的报道在国内尚不多 见 。 本实验拟设置不同时间段 、 多检测点取材 , 采用 荧光光度法测定组织内 HpD 的浓度变化 。通过测 定 , 为声动力疗法处理不同部位肿瘤的时间点提供 依据 。1 材料和方法1. 1 材 料实验所用 HpD 衍生物为单羟乙基单乙烯基次 卟啉 , 由 Sig ma

5、 公司提供 , 0. 1mol/l P BS (pH 7. 27. 4 避光溶解 , 使其终浓度为 2. 5mg/mL,过滤灭菌 , 分装于 Eppendof 管中 , 避光 -20 保存 。 S180肿瘤细胞系由中国医学科学院药物研究所引进 , 陕 西省中医药研究院实验动物中心提供 。 MCR 系小 白鼠 (雌性 , 体重 1822g , 由陕西省中医药研究 院实验动物中心提供 。 F 22500型荧光分光光度计 是日本 H itachi 公司产品 。 1. 2 方 法接种 S180肿瘤细胞于小鼠右前肢皮下 , 约一周 后 , 将小鼠随机分为 8组 , 每组 3只 , 尾静脉注射 HpD 0

6、. 2mL /只 , 使其终浓度为 25mg/kg, 避光饲养 。 分别于 2h, 8h, 12h, 24h, 36h, 48h, 72h, 96h 取材 。 取材时进行背部脱毛 , 摘眼球取血法取血 , 颈 椎离断法处死小鼠 , 取肝脏 、 肾脏 、 背部皮肤 、 大腿肌 肉和肿瘤组织放于冷生理盐水中洗涤 。 将余血洗净 后制得样品 , 将样品稀释至线形范围内后 , 用荧光光 度法 (激发波长 405n m , 发射波长 598nm 测定各 样品荧光强度57(以正常荷瘤小鼠相应组织为零 对照 , 根据标准曲线得出其在组织内的浓度 。2 结 果2. 1 标准曲线绘制配制不同浓度的 HpD 溶液

7、测定荧光值绘制标 准曲线 (表 1, 图 1 , 并做相关回归分析 。回归方 程 :y =241. 04x +3. 5257(r =0. 9947, p <0. 05 。 表 1 Hp D 梯度浓度和荧光强度Tab . 1 Grad i en t concen tra ti on and fluorescencei n ten sity of Hp D浓度 /g mL -1荧光强度 浓度 /g mL -1荧光强度 0. 0110. 090. 5116. 90. 02514. 231. 0209. 20. 0523. 441. 2319. 40. 126. 971. 4. 2. 2 HpD

8、 2. 2. 1 HpD 的荧光强度和浓度 (表 2, , 利用荧光图 1 HpD 标准曲线Fig . 1 Standard graph of HpD分光光度计测定 HpD 在各组织内荧光强度随时间的变化 , 结果见表 2。 经回归方程计算 , 得到 HpD 在 血浆和各组织内的浓度 , 结果见表 3。 2. 2. 2 HpD 的浓度 -时间曲线 (图 2, , 血浆中 HpD 代 , 8迅速分布于各组织 , 848h 后 , 平台区浓度几乎无 肾组织在静脉注射 2h 后 , HpD 浓度最 高 , 然后迅速下降 。 12h 时有小回升 , 随后继续下 降 。 皮肤和肌肉中的 HpD 含量不高

9、 , 同样在静脉注 射 2h 后迅速下降 , 然后曲线基本趋于平缓 , 在低水 平状态维持 。 肿瘤组织中的 HpD 浓度在静脉注射 后逐渐上升 , 12h 时达最大值 , 随后缓慢下降 。 36h表 2 静脉注射后 Hp D 在体内的荧光强度变化Tab . 2 Changes of fluorescence i n ten sity of Hp D after i n travenous i n jecti on时 间 /h血浆 /g mL -1肝脏 /g g -1肾脏 /g g -1肿瘤 /g g -1皮肤 /g g -1肌肉 /g g -12305. 2082. 8576. 7643.

10、4941. 8916. 62894. 4658. 4449. 5547. 4918. 4812. 081270. 1356. 1257. 3754. 3416. 718. 552430. 9451. 0743. 1738. 7312. 798. 383612. 7645. 3436. 1026. 6612. 507. 71488. 6341. 0029. 8030. 6610. 246. 07728. 2638. 0928. 8829. 938. 346. 43964. 5834. 1525. 0623. 019. 204. 82表 3 静脉注射后 Hp D 在血浆和各组织内的浓度Tab .

11、3 Concen tra ti on of Hp D i n pl a s ma and tissues after i n travenous i n jecti on时 间 /h血浆 /g mL -1肝脏 /g g -1肾脏 /g g -1肿瘤 /g g -1皮肤 /g g -1肌肉 /g g -1250. 0613. 1612. 156. 636. 372. 17815. 099. 117. 647. 302. 481. 421211. 058. 738. 948. 432. 190. 84244. 557. 896. 585. 841. 540. 81361. 536. 945. 41

12、3. 841. 490. 69480. 856. 224. 364. 501. 110. 42720. 795. 744. 214. 380. 800. 48960. 185. 083. 573. 230. 940. 22734 第 4期 汤 薇等 :荧光光度法测定血卟啉在荷瘤小鼠体内的分布 图 2 静脉注射后血浆内 HpD 浓度随时间的变化Fig . 2 Change of HpD concentrati on in p las ma after intrave 2nous injecti on图 3 HpD 在组织中的浓度变化Fig . 3 Change of HpD concentrat

13、i on in tissues after intrave 2nous injecti on后保持在一定浓度 , 曲线基本无变化 。可见 HpD 在 肝 、 肾组织中含量较高 , 皮肤和肌肉中含量较少 , 实 体瘤与血浆 、 皮肤和肌肉相比 , 静脉注射 24h 后浓 度相对较高 , 48h 后浓度高于肾 , 肝脏中的 HpD 浓 度一直高于肿瘤 。与其他组织相比 , 肿瘤组织中 HpD 代谢速度最缓慢 , 说明其对 HpD 有较强的潴留能力 。3讨论与结论根据 HpD 在体内随时间的分布情况可知 , 静脉 注射 2h 时血浆内 HpD 浓度最高 , 并且其他组织内 HpD 的含量大于或近似于

14、肿瘤组织 , 故不宜进行超声处理 。静脉注射 12h 时 , 肿瘤中 HpD 浓度达最 大值 , 皮肤 、 肌肉中的浓度远低于肿瘤组织 。 虽然血 浆中的浓度仍较高 , 但皮肤中血管分布很少 , 血流量 小 , 故可对浅表肿瘤进行超声处理 。静脉注射 48h 时 , 血浆 、 皮肤 、 肌肉中 HpD 浓度均远小于肿瘤组织 , 应为相对安全的超声处理时间点 , 此时处理对周 围正常组织损伤最小 , 且可有效杀伤肿瘤组织 , 但 肝 、 肾中 HpD 浓度仍与肿瘤组织相近 。 静脉注射 72h 后 , 其他组织和肿瘤内 HpD 浓度均降到较低值 ,此时处理虽然安全 , 但杀伤效果降低 。这可能是

15、由于血卟啉主要经肝胆肠系统及肾脏排泄 , 所以肝 、 肾 中 HpD 浓度一直高于或近似于肿瘤组织 , 超声处理 应特别注意肝 、 肾肿瘤 。 由此可见 , 不同部位的肿瘤 在选择最佳超声处理时间点应不同 。许多学者 利用 其 他 方 法 也 得 到 了 类 似 的 结 果 8, 9, 但也有学者认为 , 静脉注射 8h 后 , 肿瘤组织 中 HpD 分布较多 , 血浆中 HpD 浓度低于肿瘤组 织 3。 实验结果表明 , 在静脉注射 12h 后 , 血浆仍 保持较高的 HpD 浓度 。因此 , 我们认为 , 声动力疗法抗肿瘤处理的时间点应选择在 24h 72h 之间 。与同位素测定相比 ,

16、荧光法更加简便易行 , 灵敏准 确 , , 且稳 定性高 , 。:MURA S, Y UM I T A N, N ishiqaki R, et al . Mecha 2nis m of cell da mage by ultras ound in combinati on with he 2mat opor phyrin J .Jap J Cancer Res, 1990, 81(9 :9622966.2 孙世惠 , 刘全宏 , 齐 浩 , 等 . 低强度超声激活血卟啉对 S180细胞的杀伤作用 J .西北大学学报 (自然科 学版 , 2002, 32(2 :2112213.3 靖士侠 , 窦

17、明金 , 吴思恩 , 等 .131I 2HpD 在小鼠体内的吸收 、 分布和排泄 J .中国激光医学杂志 , 1994, 3(5 :2632268.4G OMER C J, DOUGHERTY T J. Deter m inati on of 3H 2and14C he mat opor phyrin derivative distributi on in ma 2lignant and nor mal tissueJ .Cancer Research, 1979, 39(1 :1462151.5 王克勤 , 梁亚云 . 血卟啉衍生物在生物体内的荧光测定法 J .药学通报 , 1986, 21

18、(2 :84286.6 陈祖林 , 单治堂 , 罗云生 , 等 . S W 480癌细胞内光敏剂含量检测 J .中华物理医学杂志 , 1997, 19(2 :72274.7 崔国辉 , 沈 琳 , 张 蕾 , 等 . 血卟啉衍生物脂质体瘤内注射给药在荷瘤鼠体组织中的药物分布 J .北 京大学学报 (医学版 , 2001, 33(3 :2552257.8 S VANBERG K, KJE LLE N E, ANKERST J, et al . Fluo 2rescence studies of he mat opor phyrin derivative in nor mal and malign

19、ant rat tissue J .Cancer Research, 1986, 46(8 :380323808.9 BUGE LSKI P J, P ORTER C W , DOUGHERTY T J. Au 2t oradi ographic distributi on of he mat opor phyrin derivative in nor mal and tu mor tissue of the mouse J .Cancer Re 2search, 1981, 41(11 :460624612.(编 辑 徐象平 834 西北大学学报 (自然科学版 第 35卷 Deter m i

20、 n ati on of Hp D distr i buti on i n tu mor beari n gmouse with fluorescence photo meterT ANG W ei, L I U Quan 2hong, L I U Shu 2yuan(Collage of L ife Science, Shaanxi Nor mal University, Xi an 710062, China Abstract:A i m T o p r ovide s ome basis for S DT t o dis pose tu mor at different positi o

21、n by deter m ining the distribu 2ti on of HpD in tu mor bearing mouse . M ethods The fluorescence intensities of tissues extracti ons were deter m ined t o esti m ate HpD concentrati on with fluorescence phot ometer based on the standard graph . Results HpD concentra 2ti on in tumor tissue was highe

22、r than that in skin and muscle but was l ower than in liver and kidney . I n comparis on with other tissues, metabolic vel ocity of HpD was the l owest in tumor tissue . Conclusi on According t o different metabolic vel ocity in each tissue, the vie w that tu mors in different positi on should be di

23、s posed at app r op riate ti m e res pectively was put for ward and the best treat m ent ti m e was bet w een 24h 72h . Key words:fluorescence phot ometer; HpD; S180; S DT (上接第 435页 参考文献 :1 MONOD J L. 1980, (5 :24227.2 美 ERV I N -M.闵家胤译 . 北京 :, 1988. 78286.3 英 鲍勃霍姆斯 . 各就各位 -预备 -进化 J .新科学家 , 2002, (9

24、 :628.4 童第周 . 生物科学与哲学 M.北京 :中国社会科学出版社 , 1984. 75299.5 G OLDBERGER A L. Fractal mechanis m s in the electr o 2physi ol ogy of the heartJ .I EEE EngM ed B i ol, 1992, 11(2 :47252.6, . 时间之箭 M.江 涛 , 向守平译 ., 1999. 78286. 沈淑敏 . 生物学中几个辩证关系问题 M.北京 :高等教育出版社 , 1984. 84291.8 杨联安 , 袁勘省 , 卢斌王 莹 , 等 . 土地利用管理信息系统规

25、范化与标准化初探 J .西北大学学报 (自然科学 版 , 1999, 29(2 :1682171.9 魏 诺 . 非线性科学基础与应用 M.北京 :科学出版社 , 2004. 1502152.10王兴元 . 复杂非线性系统中的混沌 M.北京 :电子工业出版社 , 2003. 1142121.(编 辑 徐象平 The opti m i zi n g selecti ve mechan is m of the evoluti on of li feW E I Nuo 1, Y ANG L ian 2an2(1. School of Science, Xi an University of A rc

26、hitecture &Technol ogy, Xi an 710055, China; 2. Depart m ent of U rban and Res ource,North west University, Xi an 710069, China Abstract:A i m T o p resent the op ti m izing selective mechanis m of the evoluti on of creatures and de monstrate it . M ethods Based on Dar win s theory of natural se

27、lectivity, the op ti m izing selective mechanis m of the evoluti on of creatures is p resented thr ough adop ti on of s ome ideas of non -Dar winis m and grand evoluti onary synthesis . Results The op ti m izing selective is based on the chaotic p r operty of creatures and the directi on depends on adap tati on .Considering the adap tati on t o