直投式酸奶发酵剂菌株发酵制备工艺研究

1、直投式酸奶发酵剂菌株发酵制备工艺研究彭亚会 高学军 * 刘营(东北农业大学乳品科学教育部重点实验室,哈尔滨 150030摘 要:对 EZAL-MY96直投式酸奶发酵剂中分离出来的 3株乳酸菌利用 5L 发酵罐进行发酵工艺研究,确 定 3株菌中每一菌株的最佳发酵工艺参数。结果表明:所获得产品的活菌数均超过 1011cfu/g,活菌率均超 过 70%,达到国外同类产品的标准。本研究结果为直投式酸奶发酵剂的工业化生产提供了重要的理论和实 验数据。关键词:直投式酸奶发酵剂;菌株发酵;制备工艺Research on Fermental Preparations Techniques of Strains

2、 of Direct Vat SetPeng Ya-hui, Gao Xue-jun*, Liu Ying(Key Laboratory of Dairy Science of Ministry of Education, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China Abstract :Each of three lactic acid bacteria from EZAL-MY96 was cultured and fermental techniques were studied by experiments with 5

3、L fermentive vessel. Technique parameters of three lactic acid bacteria were determined. Results showed that viable counts of products by choosing freeze-dried protectors of all DVS exceeded 1011cfu/g and viable organism rates of three strains all exceeded 70%, this achieved to the same product inde

4、x of EZAI-MY96. The result of study provides an important method and experimental data for developing DVS starter.Key words: Direct Vat Set; Strains Fermentation; Prepared Technique中图分类号: Q933 文献标识码 : A国内应用于酸奶生产的直投式发酵剂(Direct Vat Set, DVS用量巨大,但全部依赖于 进口 1 。随着我国发酵乳制品工业的迅猛发展,已对乳酸菌的分离鉴定、增殖培养、冻干保 存等直投式酸奶

5、发酵剂制备技术的关键问题进行了一定的研究与探讨 2。积极筛选优良菌 种、 建立直投式酸奶发酵剂制备技术, 大力开发具有我国自主知识产权的优质直投式酸奶发 酵剂势在必行。本实验对直投式酸奶发酵剂的发酵工艺中的关键技术进行研究,利用 5L 发酵罐进行发 酵工艺研究, 确定从 EZAL-MY96直投式酸奶发酵剂中分离得到的3株乳酸菌中每一菌株的 最佳发酵工艺参数。冷冻干燥后的3株乳酸菌按照一定的比例混合制备出优质的 DVS 。本 研究结果为直投式酸奶发酵剂的工业化生产提供了重要的理论和实验数据。1.材料与方法1.1材料本实验室保藏的乳酸菌单菌株(嗜热链球菌 1株,以下简称球菌;保加利亚乳酸杆菌 2株

6、,以下简称杆菌 1和杆菌 2 2。麦芽汁(青岛啤酒集团;番茄汁(本实验室自制; 脱脂粉(内蒙古呼伦贝尔农垦雪花乳业。PY 培养基; M17球菌半选择培养基; MRS 杆菌半选择培养基;复壮培养基 (乳球菌和 乳杆菌分别采用液体 M17培养基和液体 MRS 培养基见文献 3;球菌工业化液体超浓缩培 养基;杆菌 1工业化液体超浓缩培养基;杆菌 2工业化液体超浓缩培养基见文献 4。BIOF-2005型发酵罐, FD-1B-55型冷冻干燥机,高压灭菌器,超净工作台,恒温培养 箱,恒温震荡器。 1.2方法将 3株乳酸菌发酵后的发酵液在各自的生长曲线的最高值时取出,采用冷冻离心机在 4 20min ,转速

7、为 6000r/min。离心后分别加入各自湿菌体量 2倍质量的 3株乳酸菌特异性 冻干保护剂,其中冻干保护剂配方见文献 4。冷冻干燥采用程序为 -40 冻干 20h ,冻干后利 用 -80 的低温冰箱保存。测定 DVS 菌株在 5L 发酵罐培养过程中培养液总蛋白含量、甘油三酯含量变化情况, 测定培养液中乳酸含量变化情况, 具体步骤均按说明书进行操作。 实验结果均测定 3个平行, 然后求平均值。根据确定的最佳工艺参数及生长曲线, 来确定3株菌的发酵过程中最佳搅拌速度。 球菌 生长的实验基本条件为:在 5L 发酵罐装入 3.5L 增殖培养基,按 3%接种量接种,在不同转 速下, 42 恒温培养 6

8、h 终止,分别测定活菌数。杆菌 1生长的实验基本条件为:在 5L 发酵 罐装入 3.5L 增殖培养基,按 3%接种量接种,在不同转速下, 37 恒温培养 8h 终止,分别 测定活菌数。杆菌 2生长的实验基本条件为:在 5L 发酵罐装入 3.5L 增殖培养基,按 3%接 种量接种,在不同转速下, 37 恒温培养 14h 终止,分别测定活菌数。2. 结果与讨论2.1生长曲线的确定根据3株菌在 5L 发酵罐中各自活菌计数, 绘制出各自的生长曲线。 结果如图 1、 图 2。 12345678910培养时间 (h菌 数 (1010c f u m l -1图 1 球菌生长曲线 图 2杆菌的生长曲线由图 1

9、球菌的生长曲线可知,到 6h 左右活菌数达到最大值,因此发酵培养 6h 为球菌 的最佳收获期,此时的发酵液活菌数为 1.52 1010cfu/mL;由图 2杆菌 1、杆菌 2的生长曲 线可知 , 杆菌 1到 8h 左右活菌数达到最大值, 因此选择发酵培养 8h 为其最佳收获期, 此时的发酵液活菌数为 1.83 109cfu/mL;杆菌 2到 14h 左右活菌数达到最大值,因此选择发酵 培养 14h 为其最佳收获期,此时的发酵液活菌数为 1.72109cfu/mL。 2.2 DVS菌株的冻干效果球菌冻干后所得冻干粉的活菌数为 7.121011cfu/g,活菌率 71%;杆菌 1冻干后所得冻 干粉

10、活菌数为 2.101011cfu/g, 活菌率 81%; 杆菌 2冻干后所得冻干粉活菌数为 2.451011cfu/g, 活菌率 83%。由此可见,所获得产品的活菌数均超过 1011cfu/g,活菌率均超过 70%,达到 国外同类产品的标准。2.3 DVS菌株发酵培养的生化特性有研究表明:球菌、杆菌 1和杆菌 2合成的乳酸是影响发酵液 pH 值的主要物质。这与 赵鑫和 Shakeel UR等人的研究相一致 57。球菌、杆菌 1和杆菌 2的代谢产物乳酸的含量变 化见图 3、图 4。由图 3可以看出:球菌在 12h 培养液中乳酸含量最高。由图 4可以看出:杆菌 1在 10h 培养液中乳酸含量最高,

11、杆菌 2在 16h 培养液中乳酸含量最高,因此, 3株菌 合成乳酸的最大值时间均为对数生长期顶点后 2到 3h 。球菌、杆菌 1和杆菌 2在菌数达到 最高值时,菌体还继续合成乳酸, 2到 3h 后乳酸含量达到最高值,此后乳酸抑制了菌体的 增长。由图 3、图 4可知,球菌合成的乳酸量远远高于杆菌 1和杆菌 2,由此可知,球菌是 合成乳酸的重要来源。 906024乳 酸 含 量 (m m o l L -1图 3 球菌乳酸含量变化 图 4 杆菌乳酸含量变化球菌、杆菌 1和杆菌 2培养液甘油三酯的含量变化见图 5。由图 5可以看出,随着培养 时间的延长, 3株菌培养液中甘油三酯的积累呈越来越多的趋势,

12、可能与菌体合成甘油三酯 增多或菌体裂解释放甘油三酯有关。 图 5 三株乳酸菌甘油三酯含量变化球菌、杆菌 1和杆菌 2培养液中总蛋白的含量变化见图 6。由图 6可以看出,随着培养 时间的延长, 3株菌培养液中的总蛋白呈升高的趋势,这可能与菌体释放蛋白质增多以及菌 体裂解释放产生蛋白质多于原培养液中蛋白质含量有关, 或者是培养液中蛋白质被降解产生 更多数量的小分子多肽,导致试剂盒检测结果显示更高数值的关系。 图 6 三株菌培养液中总蛋白含量变化2.3搅拌转速的测定发酵罐中培养的 3株菌搅拌转速与对数生长期顶点时的活菌数之间的关系见图 7、图 8。 1.58搅拌转数 1.180(rmin -1 活

13、菌 数 (1010c f u m l -1f图 7 搅拌转数对球菌活菌数的影响 图 8 搅拌转数对杆菌的活菌数的影响 由图 7、图 8可以看出,球菌最佳搅拌度为 100r/min;杆菌 1的最佳搅拌度为 100110r/min;杆菌 2的最佳搅拌度为 110120r/min。由以上数据,确定 3株菌的发酵工艺。将球菌菌种利用 PY 增殖培养基培养 8h 制备种 子液,将球菌的种子液按照 3%的接菌量接到已灭菌球菌廉价优化培养基中,调节初始 pH 为 7.0后,发酵罐的搅拌转速为 100r/min,在 42 发酵 6h 后取出;将杆菌 1菌种利用 MRS 培养基培养 23h 制备种子液,将杆菌

14、1的种子液按照 3%的接菌量接到已灭菌的杆菌 1廉价 优化培养基中,调节初始 pH 为 6.26.4后,发酵罐的搅拌转速为 100110r/min,在 37 发酵 8h 后取出;将杆菌 2菌种利用 MRS 培养基培养 23h 制备种子液,将杆菌 2的种子液 按照 3%的接菌量接到已灭菌的杆菌 2廉价优化培养基中,调节初始 pH 为 6.26.4后,发 酵罐的搅拌转速为 110120r/min,在 37 发酵 14h 后取出。将上述 3株乳酸菌取出后,均 采用冷冻离心机进行离心, 转速为 6000r/min, 4 , 离心 20min 。 离心后分别加入 3株乳酸菌 湿菌体量 2倍质量的各自的菌

15、株特异性冻干保护剂进行冻干。 冷冻干燥采用程序为-40 冻 干 20h ,冻干后利用-80 的低温冰箱保存。3.结论本实验获得来自 EZAI-MY96中的3株乳酸菌各菌株的发酵制备工艺流程及最佳发酵工 艺参数,为直投式酸奶发酵剂的工业化生产提供理论依据。3株乳酸菌的活菌数均在 1011cfu/g,活菌率均超过 70%,达到国外同类产品(EZAI-MY96的标准。参考文献5赵鑫,赵良启,谢红.发酵生产 L-乳酸的现状与展望 J.山西化工. 2005, 25(1 .1519.6Frees D, Vogensen FK, Ingmer H. Identification of proteins induced at low pH in Lactococcus lactisJ. Int J Food Microbiol. 2003 11 1;87(3. 293300.7Shakeel UR, Farkye NY, Yim B. Use of dry milk protein concentrate in pizza cheese ma