白菜 WRKY 转录因子 cDNA 全长的克隆及分析

1、农业生物技术学报 JournalofAgriculturalBiotechnology2007,15(5):810815 研究论文白菜 WRKY 转录因子 cDNA全长的克隆及分析 *王彦华1,侯喜林2*,申书兴12.南京农业大学作物遗传与种质创新国家重点实验室， （1.河北农业大学园艺学院， 保定 071001； 南京 210095）摘要：参照拟南芥 利用 RTPCR及 RACE技术克隆了白菜 WRKY转录因子基因保守序列设计引物， 转录因子基因 cDNA 全长， 命名为(GenBank登录号为 AY836002)。序列白菜 分析发现， 与拟南芥 基因核苷酸序列长 980bp， 推导的氨基酸

2、序列编码 285 个氨基酸残基， 氨基酸序列的同源性为 74%， 与拟南芥接种后 612h， 白菜同源性为59%； 与其它植物WRKY基因的同源性则较低。Southernblot 显示该 基因的表达量最高。用2mmol/L的水杨酸处理后 28h， 基因在白菜基因组中为单拷贝。半定量 RTPCR分析表明， 以及用霜霉病菌水杨酸； RACE； 关键词： 白菜； 转录因子； 半定量RTPCR文章编号：S188A10061304(2007)05081006中图分类号：文献标识码：CloningandCharacterizationofAFulllengthcDNAofWRKYTranscription

3、FactorGenein121WANGYanhua,HOUXilin*,SHENShuxingPCRprimersweredesignedbasedontheconserveddomainoffulllengthcDNAofWRKYtranscriptionfactorwasclonedfromcationcDNAend(RACE)techniques.Sequenceanalysisindicatedthatdentitywas74%and59%togenomerespectively.transcriptionfactorsalicylicacidRACEsemiquantitativeR

4、TPCRandgenesofWRKYtranscriptionfactor.TheusingRTPCRandrapidamplifigene(GenBankaccessionnumber:AY836002)respectively.Thededucedaminoacidsequenceofwasacconsistedof980nucleotides(nt),anddeducedaminoacidsequencecontaining285aminoacids.FurthercomparisonshowedthatitsigenehaslowerhomologywithotherplantWRKY

5、genes.SouthernblottinganalysisindicatedtherewasasinglecopyinSemiquantitativeRTPCRdemonstratedthatthecorrespondingmRNAofcumulatedmostabundantly28haftertreatmentupon2mmol/Lsalicylicacid,and612hafterinfectionbyWRKY 转录因子是一类在植物中起特异作用 的转录调控因子，其名称来源于其蛋白含有高度保守的 60 个氨基酸组成的 WRKY 结构域 （郝中娜和 这类 2006）陶荣祥， 。 自上个世纪

6、九十年代中期以来，烟草、 大麦、 水 基因已在甘薯、 野燕麦、 欧芹、 拟南芥、 稻、 棉花等植物中被克隆(Chen2003Zhang,2004Xu心序列为(T)TGAC 的 W 盒结合， 激活下游基因的2000表达， 从而开启植物的防卫体系(EulgemYu2001Chen2002)。WRKY 转录因子 还影响植物的衰老、 抗胁 除参与植物的抗病反应外，,迫能力、 生长和发育及信号传导过程2000Sun2004)。研究2004Li2004Xu,2006)。WRKY 基因在植物体内并非组成型表达，而是受外界环境的激发 而诱导表达。生物胁迫如病原物及其诱发因子(YoWRKY 转录因子通过与抗病基

7、因启动子中核 表明，*基金项目： 高等学校博士点科研基金（No.20030307021） 资助。*通讯作者。Authorforcorrespondence.博士， . 教授， 主要从事蔬菜遗传育种与生物技术研究。Email： 20070130 接受日期： 20070404 收稿日期：第 5期 王彦华等: 白菜WRKY转录因子cDNA全长的克隆及分析811da2002Kalde2003Wang2005)、 用 Trizol(MDBio)试剂法。 防卫反应信号分子如水杨酸及其功能类似物(Dong、 环境胁迫如低温、 高温、 高盐和创伤(仇 玉萍等，2004)均能诱导 WRKY基因的表达。 这些结

8、果表明，WRKY 基因编码的转录调节蛋白具有多种 生理功能，在植物的发育调节和防卫反应中起重要 作用。白菜)霜霉病 是由专性寄生菌Pers.Fr） 引起的一种真菌病害，选用抗病品种是解决这一病害 的最有效途径。 近年来， 植物抗真菌病害基因工程研 究日益受到重视，而目的基因的克隆是转基因育种的基础与关键。本研究以水杨酸 （SA） 处理后的白菜 为实验材料，在已获得的 WRKY 基因 cDNA 片段的基础上 （王彦华等， 2005）， 采用 RACE(rapidamplificationcDNAend)技术，获得了白菜 WRKY转录 因子 cDNA 全长序列， 并对该基因的拷贝数及诱导 表达规律

9、进行了分析，为白菜抗霜霉病机制的深入 研究提供基础资料，并为白菜抗病基因工程提供了 基因资源。1 材料和方法1.1 材料供试材料为苏州青白菜ssp.抗病自交系， 由南京农业大学白菜课题组提供。大肠杆菌)菌株 JM109 由本实验室保存； 质粒载体 pMD18TDNA聚合酶、限制性内切酶、RNaseFreeDNase玉、 AgaroseGelDNAPurificationKit、 AMV 反转录试剂盒等均购自 TaKaRa 公司； DigDNALabelingandDetectionKit 购自 Roche 公司。 1.2 植物材料的准备将白菜种子播种于装有灭菌基质的穴盘中， 人 工气候箱中按照

10、光照 12h、黑暗 12h 光周期， 2025下培养。幼苗两片真叶时，用 2mmol/LSA KOH 调节 pH 至 6.5） 进行喷雾处理， 处理后分别于 0、2、 4、 8 和 12h 提取叶片总 RNA。 1.3 接种液制备及接种方法参照程永安和何桂兰 （1995） 的方法，对单株采 用喷雾接种， 接种后在 20黑暗中保湿 24h 后， 揭 掉遮光物， 在 2025、 相对湿度 85%5%培养，分别于接种后 0、4、 6、 12、 24 和 48h 提取叶片总 RNA。 1.4DNA 和 RNA 的提取DNA 的提取采用 CTAB 法，总 RNA 的提取采 1.5RTPCR利用 RNas

11、eFreeDNase玉去除总 RNA 中痕量DNA 污染， RT 反应参照大连 TaKaRa 生物公司的 TaKaRaRNAPCRKit(AMV)Ver.2.1 试剂盒说明 书进行。根据已获得的白菜 部分 cDNA 的序列 （王彦华等， 2005） 设计专一反向引物 W4， 以拟 南芥cDNA5 保守氨基酸设计正向简并引物 W5。在 20 滋L 的反应体系中加入上述 RT 反应液 2 滋L，正反向引物 W5 和 W4 （皆 10pmol/滋L） 各 2 滋L， 另有 1伊PCRBuffer， 200 滋mol/LdNTP， 2.0mmol/LMgCl2， 1UDNA 聚合酶。 PCR 反应程序

12、： 94变性 1min 后， 9430s， 561min， 722min30s，循环 35 次， 7210min； 4 保存。 1.63RACE参考 Li2002） 的方法， 根据已获得的白菜 WRKY 转录因子 cDNA 片段，设计一条正向引物 W3，通用引物 M4 为反向引物，退火温度为53， PCR 反应体系同上。 1.75RACE参考李秋莉等 （2001） 的方法， 根据已获得的白 菜 部分 cDNA 的序列 （表 1）， 在靠近 3 端一侧，设计一条 5 末端磷酸化反转录引物 SRTP。 在远离 3 端，设计两条反向嵌套 PCR 引物 W6 和W7；在 SRTP 近端, 设计两条正向

13、嵌套 PCR 引物 W8 和 W3。 第 1轮 PCR 以 cDNA环化反应液为模 板， 正反向引物为 W8 和 W6， 退火温度为 50。表1白菜基因克隆引物Table1PrimersforcloningcDNAfrom引物名称 引物序列 （53） 序列长度/bpPrimerPrimersequenceSequencenamelengthW2TGGAGRAARTAYGGNCARAAR21W18FGCTCCATTAACCTCCCAGAT20W3CGAAAGACTCAAAGTTCACAG21W4TGCGTCCCTTCGTATGTAGC20W5GCMWSWGARYTSCGNGAGGAGCT23W6

14、TCTCCCAGACTGCTGCTAACA21W7AGCTCCTCTCGTAACTCACTT21W8GGATCAAGCACTGTGACTTTG21SRTP(P)ATAGCAGCCGCAA 13N=A/G/C/T,R=A/G,Y=C/T,S=G/C,W=A/T,M=A/C（用812农 业 生 物 技 术 学 报 2007 年第 2 轮 PCR 除正反向引物为 W3 和 W7，退火温 度为 54。1.8 目的片段的回收及克隆片段回收按照 TaKaRa 回收试剂盒的使用说明 进行。回收的 DNA 片段连接到 pMD18T 载体 （TaKaRa） 上。连接产物转化感受态大肠杆菌用上述特异 JM109，

15、 蓝白斑筛选。煮沸法提取质粒， 隆的片段为白菜 基因的 3 末端。5RACE进行嵌套式 PCR 扩增，第 1 轮扩增未获得单一条 带，第 2 轮扩增得到了长度为 195bp 的单一条带5 端为 SRTP 引物到 W7 引物间的一段反 （图 3），3 端与 向序列， 已知序列的 5 端有 23bp 的重叠区，说明克隆的片段为白菜 端序列。基因 5引物在相同条件下进行 PCR 扩增， 琼脂糖凝胶电泳 检测插入片段的大小。 1.9Southern 杂交用限制性内切酶玉芋和 玉完全消化 20 滋g 基因组 DNA（37 过夜）， 0.8%琼脂 糖凝胶电泳 12h（ 1V/cm）， 使酶切产物充分分开，

16、 利 用碱性转移液进行转膜。探针的标记、杂交、 洗膜及 显色处理均按照 DigDNALabelingandDetectionKit(Roche)说明进行。1.10 半定量 RTPCR 分析方法选取保守的延伸因子 作为内标基因 (王彦华等，2006)，分别将 SA处理后 012h 及霜霉病 接种后 048h 的叶片总 RNA 进行反转录反应；通 过调整模板浓度，使 的 PCR 扩增产物量一 致；最后以内标基因 的引物和重新设计的白菜基因片段的引物（预期片段长度为640bp） 进行双重 PCR 分析。PCR 扩增程序为： 94 预变性 5min；9430s， 5840s， 721min， 29 个

17、循环；72延伸 10min。 1.11 序列测定及分析序列测定由上海博亚生物技术公司在 ABI377测序仪上进行；相似性比较在 NCBI 站点上用 BLAST 完成； 开放阅读框 （ORF） 在 NCBI 站点上用ORFfinder 进行分析；利用 SMART 分析推导蛋白 的结构域，利用 ExPASy(expertproteinanalysissystem)分析推导蛋白的分子量及等电点。2 结果和分析2.1基因 cDNA 全长的克隆根据拟南芥靠近 5 端的保守氨基酸设计正向简并引物 W5， 以获得的白菜的cDNA特异序列设计专一反向引物 W4，进行 PCR 扩增， 得到了长度为 550bp

18、的扩增产物 （图 1）。 将该 片段与原先获得的白菜基因 cDNA 片段进行拼接，得到了长度为 724bp 的 cDNA 片段。 3RACEPCR 扩增获得了一条 201bp 的条带（图 2），与 RTPCR 获得的 片段具有 58bp 的 重叠区，并且包含 15bp 的 poly(A)结构， 表明所克 图 1.RTPCR扩增结果 Fig.1.TheresultofRTPCRM,markerDL20001,PCRproductsusingprimerW4andW5.图 2.3RACE扩增结果 Fig.2.Theresultof3RACEM,markerDL20001,PCRproductsof

19、3RACEusingprimerW3andM4.图3.5RACE扩增结果 Fig.3.PCRproductsof5RACEM,markerDL20001,thefirstPCRamplification2,thesecondPCRamplificationproducts.根据上述 PCR 及 RACE的扩增结果，进一步第 5期 王彦华等: 白菜WRKY转录因子cDNA全长的克隆及分析813根据 5和 3序列， 设计特异引物:W1F:5GAACTTTTTGTAATGGACTGTTCT3W1R:5CGCTTTTACTCCATTTTAGAGGAA3。进行全长 cDNA的扩增，最终获得了 980bp

20、 的 白菜 基因 cDNA 全长序列 （图 4）， 命名为。在 NCBI 站点上用 ORFfinder 分析的开放阅读框 （ORF）， 表明该基因的 5端含有 12bp 的前导序列区，13870bp 构成一个完 整的开放阅读框架，编码 285 个氨基酸残基的蛋白 质 ， 含有 WRKY 转录因子的保守结构域 WRKYGQK； 然后是 110bp的 3端尾随序列区 。 将 该序列提交 GenBank， 登录号为 AY836002。图4.基因 cDNA全长的扩增Fig.4.PCRamplificationofthefulllengthcDNAofgeneM,markerDL20001,PCRpro

21、ductsusingprimerW4andW52.2基因的序列分析用 BLAST 在 GenBank 上对进行同源性检索发现， 其核苷酸序列与拟南芥 的同源性为 89%，与拟南芥 的同源性为84%， 与其它植物的 WRKY 转录因子仅在小的片段 区域存在同源性。推导氨基酸序列的 BLAST 分析 结果发现，克隆的白菜 基因与拟南芥的同源性为最高， 但也只有 74%， 与拟南芥的同源性为 59%，与拟南芥其它的WRKY 基因的同源性在 30%46%之间。而与其它 植物 WRKY 基因如伤诱导的烟草 WRKY 转录因 子基因 的同源性为 40%，与水稻的一个可能 的 WRKY 蛋白的同源性也是 4

22、0%； 与一个 TMV 诱 导的烟草应答基因的同源性则为 48%。 2.3基因的蛋白结构特征分析利用 SMART 进行基因结构分析发现，白菜基因的 N 端由 3565 位氨基酸组成的CC(coiledcoils)模体， CC 模体在蛋白质互作中起重 要作用；160220 位氨基酸为一个典型的 WRKY 结 构域，148218位氨基酸为一个富含半胱氨酸 （C） 和 组氨酸 （H） 的 C2H2 型的锌指结构，因此， 应该属于 WRKY域类。利用 ExPASy(expertproteinanalysissystem)分 析白菜 基因，推导的蛋白分子量为 31.75kD， 等电点 （pI） 为 7.

23、34， 表明该蛋白为一中性 蛋白。 2.4基因的拷贝数验证以苏州青白菜的基因组 DNA 为模板进行 PCR 扩增，得到了大小为 447bp 的、含有内含子的基因片段。将该片段回收纯化， 并进行探 针的标记。选取在基因中无酶切位点的玉芋和含有 1 个酶切位点的 玉分别对白菜基因组 DNA进行酶切，按照方法中所描 述的 Southern 杂交程序进行杂交分析。如果玉和 芋酶切产 物应出现 1 玉酶切产物应出现 2条杂交带。酶切及杂交结果见图 5， 从图中可以看出玉和 芋酶切产物均出现了 1 条较强的主带，而玉酶切产物出现了 1 条强带和 1 条弱带，说明 基因在白菜基因组中为单拷 贝。图 5.基因

24、Southernblot 结果Fig.5.Southernblottingresultof13,Suzhouqingdigestedwith玉,芋and玉,respectively.2.5SA 处理对基因表达的影响以 SA 处理后 0、 2、 4、 8 和 12h 叶片为材料， 以 内标基因的引物和基因片段的引物进行了双重 PCR 扩增。从图 6 中可以看出，SA 处理白菜后 28h 内其 mRNA 的积累一直维持较 高水平， 之后其表达明显减弱，处理后 12h 的表达 量只有 8h 的 1/3 左右。说明 SA 处理快速诱导了基因的表达。2.6 霜霉病菌接种处理对 基因表达的影响814农 业

25、 生 物 技 术 学 报 2007 年4、 6、 12、 24、 48 和 72h 利用霜霉病菌接种后 0、 叶片为材料 ， 以内标基因的引物和基因片段的引物进行了双重 PCR 扩增。h 一直保持着较高的表达水平(Yu2003)。烟草的和2001Dong亦受 SA2mmol/LSA 处理后 30min 其 mRNA 的快速诱导，从图 7 中可以看出，霜霉病菌接种后 4h 内其mRNA开始积累， 接种后 6h 达到高峰， 直至接种后 12 和 24h 后其表达明显减弱，直至接种后 72h 一 直维持低水平表达。图 6.SA处理后不同时间 基因的表达 Fig.6.Timecourseanalysi

26、sofgeneexpressionupontreatmentwithSAM,markerDL2000.图 7.接种霜霉病菌后不同时间 基因的表达 Fig.7.TimecourseanalysisofgeneexpressionuponinoculationwithM,markerDL2000.3 讨论在拟南芥 WRKY域中等均受 SA 的快速诱导，2mmol/LSA 处理后 24h 其 mRNA 积累 均达到高峰。特别是 ， 在处理后 1h其 mRNA即有明显的积累，直至处理后 8参 考 文 献ChenCHandChenZX.Isolationandcharacterizationoftwo开

27、始积累， 2h 即达到高峰(Chen,2000)。 本实验中，以 2mmol/LSA 处理白菜后 28h 内其 mRNA 的积累一直保持较高的水平，之后其表达明显减弱， 处理后 12h 的表达量只有 8h 的 1/3 左右。说明在 白菜基因同样受 SA 的快速诱导。在拟南芥 WRKY芋中， 用霜霉病菌接种抗病生态型 Columbia（ Col0） 和均受到不同程度的诱导，但是诱导速度延迟于 SA 和 在接种 4h 后，其 mRNA 积累达到高 峰 ； 和 在接种后 6h，其 mRNA 和则分别在接种后 24h和 48h达到积累高峰。这些基因的诱导表达 模式反映了它们参与不同保护信号转导途径中的

28、抗 病反应(Kalde2003)。 在拟南芥 WRKY域中，在 用番茄细菌性溃疡病菌接种后 24h 和其mRNA 表达量迅速增加， 和 在接种后 4h 其 mRNA和在接种后 8h 表达量最高， 而 和在接种后 2h 其 mRNA积累即达到了高峰。但 是只有 和 在接种后 24h 尚维持高 和 在接种后 24h 已经检测不到其表达(Dong2003)。水稻的 基因受非亲和稻瘟病菌的快速诱导，接种后 3h 其mRNA即有明显的积累， 接种后 12h 积累达到高峰(Wang2005)。在本实验中， 用霜霉病菌接种苏州青白菜抗病自交系 4h 基因开始表达， 6h 后其 mRNA积累达到高峰， 一直维

29、持至接 种后 12h， 其诱导速度明显延迟于 SA处理。这与拟 南芥 WRKY芋中的 和 在接种霜霉 病菌后及 WRKY域中和在接种番茄细 菌性溃疡病菌后的的表达情况类似。按照 Kalde(2003) 划分的基因表达模式， 26h 内 mRNA 积 累迅速达到高峰的属于早期应答基因，说明白菜基因的表达属于对霜霉病菌早期应答的基因，在抗霜霉病的信号转导中具有重要的作用。pathogenandsalicylicacidinducedgenesencodingWRKYDNAbindngproteinsfromtobacco(J).2000,42:387396第 5期 王彦华等: 白菜WRKY转录因子

30、cDNA全长的克隆及分析815ChenCHandChenZX.Potentiationofdevelopmentallyregulatedplantdefenseresponsebyapathogeninducedtranscriptionfactor(J).2002,129:706716ChengYA（程永安） andKeGL(柯桂兰).FactorsaffectingevaluationofChinesecabbageresistancetodownymildew(J).(西北农业学报),1995,4(4):6972(inChinesewithEnglishabstract)DongJX,

31、ChenCHandChenZX.Expressionprofilesofthegenesuperfamilyduringplantdefenseresponse(J).2003,51:2137EulgemT,RushtonPJ,RobatzekSandSomssichIE.TheWRKYsuperfamilyofplanttranscriptionfactors(J).HaoZN（郝中娜） andTaoRX(陶荣祥).StudyofWRKYtranscriptionfactorsuperfamily(J).(生命科学),2006,18(2):175179(inChinesewithEnglis

32、habstract)KaldeM,BarthM,SomssichIEandLippokB.MembersoftheWRKYgroup 芋transcriptionfactorsarepartofdifferentplantdefensesignalingpathways(J).2003,16:295305LagaceMandMattonDP.CharacterizationofaWRKYtranscriptionfactorexpressedinlatetorpedostageembryosof2004,219:185189LiJ,BraderGandPalvaET.TheWRKY70tran

33、scriptionfactor:Anodeofconvergenceforjasmonatemediatedandsalicylatemediatedsignalsinplantdefense(J).2004,16:319331LiQL,GaoXR,YuanXD,LiuDWandAnLJ.Rapidamplificationof3cDNAendofSuaedaliaotungensisbetainealdehydedehydrogenaseusingonestepPCR(J).2002， 24（ 2）：179181LiQL(李秋莉),GaoXR(高晓蓉),FanQ(范琦),YuanXD(袁晓东

34、),LiuDW(刘大伟)andAnLJ(安利佳).Rapidamplificationof5cDNAendofbetainealdehydedehydrogenasebyinversenestedPCR(J).(高技术通讯),2001,11:1719(inChinesewithEnglishabstract)QiuYP(仇玉萍),JingSJ(荆邵娟),FuJ(付坚),LiL(李璐)andYuDQ(余迪求).Cloningandanalysisofexpressionprofileof13WRKYgenesinrice(J).科学通报),2004,49:18601869(inChinese)SunCX,PalmqvistS,OlssonH,VorenM,AhlandsbergSandJanssonC.AnovelWRKYtranscriptionfactor,participatesinsugarsignalinginbarleybybindingtothesugarresponsiveelementsoftheisolpromoter(J).2003,15:20762092WangHH,XieK,WuKLandGuoZJ.IsolationofariceWRKYgenewhoseex