绿豆中苹果酸脱氢酶的性质及生物进化的研究

1、Vol. 6No. 1Mar. 2006Journal of Chinese Institute of Food Science and Technology中 国 食 品 学 报第 6卷第 1期2006年 3月绿豆中苹果酸脱氢酶的性质及生物进化的研究汪少芸叶秀云饶平凡(福州大学生物工程研究所福州 350002摘要首次报道了豆科植物来源的苹果酸脱氢酶 绿豆苹果酸脱氢酶的纯化及表征 。 前期实验结果已于2005年发表于 Journal of Food Biochemistry , 本文对该绿豆中苹果酸脱氢酶的性质及生物进化等做了进一步研究 。 结果显示 :苹果酸脱氢酶对底物草酰乙酸的米氏常数为

2、112mol/L 。 酶活性受金属离子效应物影响 , 其中KCl 对酶有激活作用 , CaCl 2和 MgCl 2对酶活影响不大 , ZnCl 2、 PbCl 2和 CuSO 4表现出不同程度的抑制酶活作用 。锌离子对该酶的作用属于非竞争性抑制 。 通过 Edman 降解法测定其 N-氨基酸序列为 N-ASEPGPERKVAVL-GAAGGIG-20, 与其它植物来源的苹果酸脱氢酶的同源性分别达到 75%95%。 采用 CLUSTAL W 多序列比对软件产生的进化树结构 , 与绿豆亲缘关系由近至远依次是大豆 、 苹果树 、 西瓜 、 土豆 、 芥菜 、 苜蓿 、 番茄 。 关键词 绿豆苹果酸脱

3、氢酶金属离子抑制进化文章编号1009-7848(2006 01-0262-05苹果酸脱氢酶 (malate dehydrogenase , MDH 是真核细胞和原核细胞三羧酸循环 (TCA 的关键 酶之一 。 它在柠檬酸循环中催化苹果酸形成草酰 乙酸 , 也可催化草酰乙酸形成苹果酸 。 而草酰乙酸 是生物体内生化反应的一个重要的中间产物 , 连 接多条重要的代谢途径 , 是氨基酸形成所必需的 碳骨架的主要来源之一 1。 除此以外 , 苹果酸脱氢 酶还在细胞的多 种 生 理 活 动 中 扮 演 着 重 要 的 角 色 , 涉及线粒体的能量代谢 、 苹果酸 -天冬氨酸穿 梭系统 、 植物的抗病性

4、(其酶活力的异常变动可作 为植物对疾病易感性和抗病性早期鉴别的手段 以及植物抗病过程中的活性氧代谢等 。 在 C4植物 光合作用中苹果酸脱氢酶也担负着重要的功能 。 一些 C4旱生植物如玉米 、 甘蔗等 , 为保证有足够 浓度的 CO 2参与 C3光合碳还原循环 , 进入叶组织 的 CO 2首先在叶肉细胞中与烯醇式磷酸丙酮酸反 应生成草酰乙酸 , 草酰乙酸经苹果酸脱氢酶作用 生成苹果酸后被输送到维管束鞘细胞 , 并进一步 由苹果酸酶作用释放出 CO 2进入 C3循环 。 所以MDH 系统不仅是研究酶区域化和酶调节的好系统 , 也为研究各细胞器之间的联系和许多发育问题提供了方便 12。苹果酸脱氢

5、酶作为生物代谢的关键酶之一 , 其研究意义十分重大 。 目前已从水稻 、 玉米中筛选 出苹果酸脱氢酶基因 , 并对其进行克隆 、 表达以及 生物活性的研究 , 其中有相当一部分是关于西方 蜜蜂苹果酸脱氢酶基因与配合力及杂种优势的研 究 , 也有关于动植物的发育期间苹果酸脱氢酶同工酶的分析 34, 但对于豆科植物中苹果酸脱氢酶的研究 , 目前还未见报道 。本研究的前期工作是通过食品生化的方法得 到纯化的绿豆苹果酸脱氢酶 , 并对其酶的比活力 、 回收率 、 等电点 、 作用温度 、 pH 和热稳定性等性质 进 行 了 表 征 , 结 果 发 表 于 Journal of Food Bio-che

6、mistry 5。 本文旨在此基础上对目前国内外首例报道的豆科植物苹果酸脱氢酶做进一步的研究 , 包括金属离子对酶活的影响 、 金属离子对酶活的 抑制类型 、 通过 Edman 降解法测定其 N-氨基酸 序列并比较其与其它植物来源的苹果酸脱氢酶的 同源性及生物进化关系 。1材料与方法1.1材料与仪器苯异硫氰酸 、 三甲胺及 PTH-氨基酸标准品等收稿日期 :2005-08-29资助项目 :福建省教育厅资助项目 (No.JB05040 作者简介 :汪少芸 , 女 , 1970年出生 , 副教授 通讯作者 :饶平凡第 6卷 第 1期绿豆中苹果酸脱氢酶的性质及生物进化的研究 图 1苹果酸脱氢酶对草酰

7、乙酸的米氏常数Fig.1Determination of K m value of malate dehydrogenase for oxaloacetate试剂 , 美国 PE 公司 ; 辅酶 NADH 及底物草酰乙酸 (OAA , Sigma 公司 。 实验所用的其它所有试剂均 为国产分析纯 。蛋白质固相序列分析仪 (Applied Biosystems476A , 美国 PE 公司 ; Bio -10型可见紫外分光 光度计 , 美国 PE 公司 。 1.2样品的制备利 用 硫 酸 铵 沉 降 、 弱 阳 离 子 色 谱 CM-Sephadex C-50、 POROS 20HS 高效液相强

8、阳离子交换色谱等方法从绿豆中分离纯化出生物活性物 质苹果酸脱氢酶 MDH 7, 并经 SDS-聚丙烯酰胺凝 胶电泳 、 反向毛细管色谱鉴定纯度后 , 收集样品备 用 。1.3米氏常数 K m 的测定试验中固定 NADH 为 150mol/L 不变 , 草酰乙 酸 的 浓 度 分 别 配 制 为 50、 100、 150、 200、 300、400和 600mol/L 。 取纯化的苹果酸脱氢酶样品 1mg , 按照 Sayre 6方法测定各自的酶活力 。 绘制 Lineweaver-Burk 图 , 计算出苹果酸脱氢酶在 30 下对底物草酰乙酸 (OAA 的 K m 值 。 1.4金属离子对酶活

9、的影响分别配制浓度为 1.0mmol/L 和 2.0mmol/L 的 KCl 、 CaCl 2、 MgCl 2、 ZnCl 2、 PbCl 2和 CuSO 4溶 液 , 加 入到含 0.2mmol/L 草酰乙酸和 0.15mmol/L NADH的磷酸缓冲液中 , 以未加任何金属离子的体系作 为空白对照 , 在 pH 7.4、 30 为标准条件下 , 检测 金属离子对酶活的影响 。1.5金属离子对酶活的抑制类型以 ZnCl 2为例 , 配制浓度为 1.0mmol/L 和 3.0mmol/L 的 ZnCl 2溶液 , 同米氏常数测定方法测定 各自的酶活力 , 绘制 Lineweaver-Burk

10、图 , 计算金属离子对酶活的抑制类型 。1.6N-末端氨基酸序列测定高 度 纯 化 的 样 品 经 SDS-PAGE 鉴 定 为 电 泳纯的蛋白溶液 , 将其吸附在玻璃纤维素膜上 , 并放 入测序仪的反应腔中进行测序 。 根据 Edman 降解 法测定蛋白质 N-末端氨基酸序列原理 , 对苹果酸 脱氢酶的测定结果进行分析 , 最终得到 N-末端序 列 。1.7氨基酸序列比对及进化关系分析CLUSTAL W. 生物信息学软件 7是使用最广泛的多序列比对程序 , 它采用渐进的方法 , 先将多 个序列两两比对构建距离矩阵 , 反应序列之间的 两两关系 , 然后根据距离矩阵计算产生系统进化 指导树 ,

11、 对关系密切的序列进行加权 , 再从最紧密 的两条序列开始 , 逐步引进邻近的序列 , 不断重新 构建比对 , 直到所有序列都被加入为止 , 从而使序 列比较的结果更可靠 。2结果与分析2.1米氏常数 K m 的测定在 30 、 pH 7.4条件下测量不同底物浓度下的反应速度 (酶催化反应的初速度通常可以用酶 活表示 , 1个酶活单位以 unit 表示 , 并描绘 1/V 对 1/OAA 的双倒数曲线图 (如图 1所示 。 拟合的 线性方程为 :y =11.154x +99.651。 根据米氏常数 的原理 , 令图 1中纵坐标 y =0, 则横坐标 x 的截距 为 -99.651/11.154

12、=-8.934, 而 -1/K m =-8.934, 所 以可得底物草酰乙酸 OAA 的米氏常数 K m =112mol/L 。有资料表明 , 细菌 MPOB 的苹果酸脱氢酶对 草酰乙酸 OAA 的米氏常数 K m 为 50mol/L8, 绵羊肝脏的苹果酸脱氢酶对草酰乙酸 OAA 的米氏 常数 K m 为 400mol/L 9。而绿豆 MDH 对草酰乙酸 OAA 的米氏常数 K m 为 112mol/L , 介于它们之间 , 说明酶催化反应时酶和底物草酰乙酸的亲和 力居中 。2.2金属离子对酶活的影响受试金属离子对酶活力的影响见表 1。 不同的金属离子对 苹 果 酸 脱 氢 酶 活 性 的 影

13、 响 是 不 同263中 国 食 品 学 报2006年第 1期 的 , 如 KCl 对酶有激活作用 ; CaCl 2和 MgCl 2对酶 活影响不大 ; ZnCl 2、 PbCl 2和 CuSO 4表现出不同程 度的抑制酶活作用 , 其中 CuSO 4的抑制能力最强 , 当其浓度为 1mmol/L 时 , 酶活被抑制率达 97%。2.3金属离子对酶活的抑制类型以 ZnCl 2为例 , 测定其抑制类型 , 结果见图 2。 由图 2可以看出 , 在锌离子存在的情况下 , 1/V 增 大 , 即反应速度和最大反应速度减小 , 但 K m 不变 , 所以可以判断锌离子对该酶的作用属于非竞争性 抑制 。

14、2.4N-末端氨基酸序列测定将纯化的样品放入测序仪的反应腔中进行测序 , 根据 Edman 降解法测定蛋白质 N-末端氨基 酸序列原理 , 对测定结果进行分析 , 最终得到的N-末 端 序 列 为 N-ASEPGPERKVAVLGAAGGIG-20, 即 :N-丙氨酸 、丝氨酸 、 谷氨酸 、 脯氨酸 、 甘氨 酸 、 脯氨酸 、 谷氨酸 、 精氨酸 、 赖氨酸 、 缬氨酸 、 丙氨 酸 、 缬氨酸 、 亮氨酸 、 甘氨酸 、 丙氨酸 、 丙氨酸 、 甘氨 酸 、 甘氨酸 、 异亮氨酸 、 甘氨酸 -20。2.5氨基酸序列比对及进化关系分析索到包括大豆 、 苜蓿和芥菜等 8种不同植物来源的MD

15、Hs 的 N-末端氨基酸序列 , 如表 2所示 。 应用CLUSTAL W 多序列比对软件 1将它们与绿豆 MDH 进行了 N-末瑞氨基酸序列比较 , 结果见表 2。表 1金属离子对苹果酸脱氢酶活力的影响Table 1The effect of metal ions on malate dehydrogenase activity化学试剂 浓度 /mmol L -1相对酶活力 /%空白对照13.1020.00表 2不同植物来源的 MDH 的 N-末端氨基酸序列位点与同源性比较Table 2N-terminal amino acids sequence and their homology co

16、mparison among different plant MDHsMDH 来源残基N-末端氨基酸序列 残基同源性 /%绿豆 (Phaseolus mungo 1ASEPGPERKVAVLGAAGGIG 20100大豆 (Glycine max 27ASEPVPERKVAVLGAAGGIG 4695苜蓿 (Medicago sativa 24ATEPVPERKVAILGAAGGIG 4385土豆 (Solanum tuberosum 23ASESAPDRKVAILGAAGGIG 4280西瓜 (Citrullus lanatus 28ATESVPERKVAVLGAAGGIG 4785苹果树

17、(Eucalyptus gunnii 29_SESVPERKVAVLGAAGGIG 4789番茄 (Lycopersicon esculentum 27ASGSAPERKVAVLGAAGGIG 4685芥菜 (Arabidopsis thaliana 23ASESVPDRKVVILGAAGGIG 4275相同或保守的位点 (*, :表示 :. *:*. :*图 2锌离子对酶活的抑制类型Fig.2The inhibition type of zinc to enzyme activity264第 6卷 第 1期绿豆中苹果酸脱氢酶的性质及生物进化的研究 图 3不同植物来源的 MDHs 进化树结构F

18、ig.3The phylogenetic tree of different plant MDHs参 考 文 献1. Goward C.R. , Nicholls D.J. Malate dehydrogenase :A model for structure , evolution and catalysis J. Prot. Sci. , 1994, 3:188218882. Gietl C. Malate dehydrogenase isoenzymes :cellular locations and role in the flow of metabolites between the

19、 cytoplasm and cell organelles J. Biochim. Biophys. Acta , 1992, 1100:2172343. Ocheretina O. , Scheibe R. Cloning and sequence analysis of cDNAs encoding plant cytosolic malate dehydrogenaseJ. Gene. , 1997, 199:1451484. Harrison J. F. , Nielsen D. I. , Page R. E. Malate dehydrogenase phenotype tempe

20、rature and colony eVects on flight metabolic rate in the honey-bee Apis mellifera J. Funct. Ecol. , 1996, 10:81885. Wang Shaoyun , Ye Xiuyun , Rao Pingfan et al. Purification and characterization of a malate dehydrogenase from Phaseolus mungo (mung bean J. Journal of food biochemistry , 2005, 29(2 :

21、1171306. Sayre RT , Kennedy RA , Dringnitz DJ. Photosynthetic enzyme activities and locatization in mollugo verticillata popula-tion differing in the levels of C3and C4cycleoperation J. Plant Physiol. , 1979, 64:2932997. Higgins D. G , Thompson J. D , Gibson T. J. Using CLUSTAL for multiple sequence

22、 alignments J. Methods Enzy-mol. , 1996, 266:3834028. Van Kuijk , B. L. M. and Stams , A. J. M. Purification and characterization of the malate dehydrogenase from the syn-trophic propionate-oxidizing bacterium strain MPOB J. FEMS Microbio. Lett. , 1996, 144:1411449. Vessal M. and Tabei S. M. B. Part

23、ial purification and kinetic properties of cytoplasmic malate dehydrogenase from Ovine Liver Echinococcus granulosus protoscolices J. Comp. Biochem. Physiol. B. Biochem. Mol. Biol. , 1996, 113:757763由表 2可以看出 , 绿豆 MDH 与其它植物来源 的 MDHs 的同源性在 75%95%不等 , 与豆科来源 的大豆同源性最高 , 达到 95%。 由此可见 , 本实验 用的绿豆 MDH 与其它同功能

24、的 MDHs 具有较高 的相似性 , 而且被比较的 MDHs 之间相同或保守 的位点很多 , 在 20个位点中就有 15个之多 。不同植物来源的 MDHs 的 N-末端氨基酸序 列采用 CLUSTAL W. 多序列比对软件产生的进化 树结构 (Phylogenetic Tree 如图 3所示 。 进化树结构是对不同物种的同源蛋白质的氨基酸组成顺序 或相应的核酸的核苷酸组成顺序的差异进行比较 研究 , 进而确定它们的亲缘关系 、 分歧年代和进化 速度 。 由图 3可知 , 被比较的这些 MDHs 亲缘关系 比较密切 , 从分化距离的远近来看 , 与绿豆亲缘关 系最密切的是大豆 , 其次由近至远依

25、次是苹果树 、 西瓜 、 土豆 、 芥菜 、 苜蓿 、 番茄 。3结论绿豆苹果酸脱氢酶对草酰乙酸的米氏常数 K m为 112mol/L , 介于文献所报道的 50400mol/L 之间 , 说明酶催化反应时酶和底物草酰乙酸的亲和 力居中 。 苹果酸脱氢酶活性受金属离子效应物的影 响 , 即 KCl 对酶有激活作用 , CaCl 2和 MgCl 2对酶活 影响不大 , ZnCl 2、 PbCl 2和 CuSO 4表现出不同程度 的抑制酶活作用 。 因此在调节苹果酸脱氢酶活性时 , 应根据不同的金属离子对苹果酸脱氢酶活性的 影响而控制酶活的大小 。265中 国 食 品 学 报2006年第 1期!韩

26、国推出可降血糖面包据悉 , 韩国浦项机构农协利用栽培的 7种农产品 , 生产出一种具有降血糖功能的 “ 蘑菇南瓜面包 ” 。 “ 蘑菇南瓜面包 ”的原料为再生蘑菇 、 韩国大米 、 冬虫夏草 、 南瓜粉 、 南瓜汁 、 桑蘑提取液 、 干草提取 液 。 再生蘑菇是蘑菇栽培农民李才旭在去年年初成功培育出的新品种蘑菇 , 经实验 , 对调节血糖有明显 效果 。 据浦项一大学临床营养系的吴承熙教授及韩国蘑菇协会临床实验表明 , 再生蘑菇的降血糖功能仅 次于胰岛素 。蘑菇南瓜面包曾在去年农协中央会和中小企业振兴厅承办的 “ 农产品品评会 ” 及 “ 农产品风险大战 ” 中分获鼓励奖 。(消息来源 :

27、中国食品报 The Research on Further Property and Phylogenetic Relationshipof Malate Dehydrogenase from Mung BeanWang ShaoyunYe XiuyunRao Pingfan(Institute of Biotechnology , Fuzhou University , Fuzhou 350002Abstract The study was reported for the first time that a novel malate dehydrogenase was purified from leguminousplants. The research was focused on further property and phylogenetic relationship of malate dehydrogenase (MDH from mung bean (Phaseolus mungo , in succession with the early results publi