急性早幼粒细胞白血病患者微小残留病检测和临床意义

1、急性早幼粒细胞白血病患者微小残留病检测和临床意义             作者:任海全，唐天华，毕可红，张玉昆，赵良玉，郭桂月，刘秀兰，姜枫勤，刘传芳，彭军，田志刚   摘要  目的  检测完全缓解后急性早幼粒细胞白血病患者微小残留病(MRD)，同时分析其对预后判断的指导价值。方法  建立逆转录PCR(RT/PCR)用以检测APL患者PML/RAR。结果  RT-PCR方法敏感而可重复。治疗前APL患者的RT-PCR阳性率为9

2、2.8%(39/42)，而维甲酸或化疗诱导完全缓解后MRD阳性率为56.7%(21/37)。另外，MRD阳性与缓解后APL患者的复发有关，并可以作为缓解后预测APL患者复发的指标。同时有助于指导临床上采取巩固治疗而防止复发。结论  RT-PCR能够检测APL患者的MRD和作为预测复发的指标。        关键词  急性早幼粒细胞白血病；微小残留病；RT/PCR        白血病患者完全缓解（CR）后的微小残留病（MRD）已被证实与复发有关1。MRD的

3、检测也成为指导缓解后进一步化疗的重要指标2。在目前血液病的应用实践中，MRD检测的最好例子是骨髓移植后RT-PCR法检测慢性粒细胞白血病（CML）的BCR-ABL融合基因3。        急性早幼粒细胞性白血病（APL）以特异的染色体t（15;17）（q22;q21）易位为特征4。最近，许多实验室发现t（15;17）易位后，通过15染色体上的PML基因和17染色体上的RAR基因并列而导致融合基因PML/RAR形成5。根据PML断裂点的位置不同，可以产生2个主要的PML/RAR异构体。断裂点位于PML内含子3或4（bcr3），则PML

4、外显子3（P3）和RAR外显子3（r3）之间形成短（S）型融合mRNA产物，而断裂点位于PML内含子6（bcr1）或下游，PML内含子6（P6）和RAR外显子（r3）形成长（L）型融合体6，7。RT-PCR法的建立正是依赖于断裂点的位置而设计适当寡核苷酸引物，继而扩增PML/RARmRNA异构体8。另外，RT-PCR的高度敏感性使得MRD的检测成为可能，并可在APL患者临床缓解期时早期预测白血病的复发。        1  资料与方法        1.1 

5、; 病例选择  本研究中的42例患者均为19932000年发病，男26例，女16例，年龄1272岁，根据FAB标准9诊断为APL。全部病例均经全反式维甲酸（ATRA）治疗3060mg/（m2·d）诱导缓解。巩固化疗方案为标准的HOAP或DA方案。巩固治疗后处于缓解期的患者采用全国维甲酸协作治疗组建议的ATRA与化疗联合治疗方案维持治疗10。骨髓单个核细胞用Ficoll分离并保存于液氮中。        1.2  RNA提取  10ml淋巴细胞分离液加于试管中，然后2ml骨髓细胞缓慢加入试管中，离

6、心4000r/min 20min。取单个核细胞移入另一试管中，再用异硫氢酸胍-酚-氯仿一步法抽提RNAs11。提取时注意避免样品间的交叉污染。        1.3  筑巢式RT-PCR检测  APL的PML/RAR检测方法：8个寡核苷酸引物用于逆转录、扩增，检测其长或短型异构体。        逆转录引物：A 5-TGGATGCTGCGGCGGAAGAAGCCCTTGCAG-3    PML/RAR引物：B 5-GTCATA

7、GGAAGTGAGGTCTTC-3C5-CCGATGGCTTCGACGAGTTC-3  D5-CTCACAGGCGCTGACCCCAT-3E5-AACAGCAACCACGTGGCCAG-3F5-TTCAAGGTGCGCCTGCAGGA-3  G5-AGCCTGAGGACTTGTCCTGA-3H5-GCTGCTCTGGGTCTCAAT-3 正常RAR转录引物：I5-GCCTCCCTACGCCTTCTTCTTCT-3 J5-AAAGCAAGGCTTGTAGATGC-3  K5-GACCACTCTCCAGCACCA-3L5-GCTGGGCACTATCTCTTCAGAAC

8、T-3     RT-PCR方法与步骤按照早期报道的方法进行12。        1.4  PCR产物分析  取10l第2轮PCR产物在1.5%琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭1g/ml染色，照相。并移至尼龙膜上，用5末端寡核苷酸探针（H）杂交，放射自显影30min，拍片。        1.5  统计学方法  采用t检验。    2  结果   

9、;     2.1  PCR产物的结果及其敏感度  PML/RAR的L、S异构型（见图1）。RT-PCR的敏感度为2.5×10-6。 图1  PML/RAR类型     2.2  RT-PCR阳性百分率  用全反式维甲酸治疗前APL患者PML/RAR的检测，34例为L型阳性，5例为S型阳性。L型、S型或2型的总阳性百分率分别为80.9%（34/42）、11.9%（5/42）和92.8%（39/42）。APL患者CR后的MRD阳性率是56.7%（21/37）。见表1。 表1&#

10、160; APL患者RTPCR检测阳性率的变化 注：*2 cases with APL not getting CR     2.3  APL患者MRD的变化  缓解不同时期的APL患者MRD的变化（见图2）。结果显示：CR后MRD百分率降低，57年MRD百分率比缓解后低（P<0.05）。另外，长期CR的7例中有5例生存超过7年，并且持续MRD阴性。 图2  CR时间与MRD变化关系     2.4  复发与MRD之间的关系  见表2。结果显示，在2年和3年内，MRD阴性的APL

11、患者复发百分率低于MRD阳性APL患者的复发百分率（P<0.05）。缓解2年和3年内，MRD阴性患者第一次复发的平均时间（月）低于MRD阳性患者（P<0.05）。表2  MRD阳性和MRD阴性患者复发百分率和复发时间变化    P-S:survival percent of the MRD positive    P-F: disease-free survival percent of the MRD positive N-S:survival percent of the MRD negativeN

12、-F:disease-free survival percent of the MRD negative 图3  MRD阳性和MRD阴性患者无病生存率和存活百分率比较     2.5  MRD检测对治疗的指导意义  APL患者CR后MRD检测的意义在于指导此病的治疗，尤其是当MRD阴性转为MRD阳性时。CR后7例MRD阴性转为MRD阳性时给予巩固化疗。7例中有4例再一次转阴。他们均无病状态存活超过5年。另有3例存活3年无复发。相反，4例转为阳性无巩固治疗的MRD检测316个月复发。其中2例没有获得第2次缓解而死亡。 

13、0;      2.6  无病生存率与存活百分率  MRD阳性和MRD阴性患者持续无病存活百分率和总的存活率（见图3）。结果显示，第一次CR后1或2年时2组之间的无病生存率或总的存活率差异无显著性（P>0.05）。随访3或5年，MRD阴性患者的无病生存率均明显高于MRD阳性患者（P<0.05）。3年时的2组存活率差异无显著性（P>0.05），而5年时两组的存活率差异有显著性（P<0.05）。        3  讨论  &

14、#160;     已经证实ATRA可以有效地诱导APL患者取得完全缓解10，13。根据本研究结果和其他报道材料，患者伴有t（15;17）或PML/RARRT-PCR阳性的APL患者约95%以上对于足够疗程的ATRA有效。然而，单独应用ATRA作为缓解后的治疗，大多数患者在6个月内复发14。说明尽管ATRA在临床上可以有效地诱导APL患者完全缓解，但在大多数患者中它不能充分消除白血病细胞克隆。因为APL患者复发的原因之一是由于MRD的存在，因此CR后应该采用化疗与ATRA治疗相结合，以消除MRD和预防复发。     

15、0;  尽管化疗或ATRA能诱导APL患者的临床缓解，但少量的恶性细胞仍在体内存留或成为MRD状态。MRD是白血病复发的最重要的原因。但它很难通过外周血的常规形态学检测到，而只能通过特异和敏感的PCR或RT-PCR方法检测到。在目前的研究中，RT-PCR检测APL中的MRD是有应用价值的。因为其敏感度是2.5×10-6，它足以检测MRD。此与其他报道结果相似15。用建立的RT-PCR方法进行PML/RAR融合基因检测，即用于检测APL缓解后的MRD。结果显示，初诊时L型异构体、S型异构体或总异构体阳性百分率分别是80.9%（34/42），11.9%（5/42）和92.8%（

16、39/42）。而APL患者CR后MRD阳性率为56.7%（21/37）。MRD百分率低于其他报道15。可能与敏感度大小或选择的不同病例有关。        2年和3年内，APL患者MRD阴性的复发率低于MRD阳性者（P<0.05），而MRD阳性患者缓解后第一次复发的平均时间（月）低于其阴性者（P<0.05）。因此，提示MRD阳性患者易复发16，MRD检测可作为预测复发的指标。另外，MRD百分率随着CR后的时间延长而减低。如5年和7年MRD百分率明显低于初次CR后的相应MRD百分率（P<0.05）。以往未见类似现象的报

17、道。另一方面，7例长期CR超过7年的患者中，有5例持续MRD阴性。        APL缓解后检测MRD的意义在于指导此病的治疗。尤其当MRD阴性转为阳性时。本研究中7例缓解后患者从MRD阴性转为阳性，在给予巩固治疗后，有4例再一次转阴，并在无病状态下存活超过5年。另有3例也存活3年无复发。相反，有4例MRD转为阳性者没有给予巩固治疗，在MRD检出后的316个月内复发，其中2例没有得到第2次缓解而死亡。根据目前研究结果，MRD阳性，尤其是由阴性转为阳性者，可以指导临床工作者采取进一步治疗措施（如巩固治疗），以尽可能早的消除MRD，并获

18、得长期缓解。        另外，在第一次CR后的12年内，MRD阴性和阳性2组之间的存活百分率或无病生存率差异无显著性（P>0.05）。但在3和5年时，2组间的无病生存率差异有显著性，MRD阳性者低于其阴性者（P<0.05）。至于存活百分率方面，3年时2组之间无明显差别，5年时差异明显。因此，此结果进一步说明RT-PCR检测MRD能预告APL复发。与陈竺等15的报道结果一致。但是，后者比我们观察的时间短。        总之，在APL缓解期经ATRA或巩固治疗后

19、MRD阳性者有可能复发。据此我们建议APL患者CR后最好应用RT-PCR连续检测MRD，当缓解期MRD阳性时，及时给予治疗（巩固化疗，ATRA或亚砷酸治疗）。 参考文献     1  Baruchel A，Schaison G. Detection of minimal residual disease in leukemias. Nouv Rev Fr Hematol，1990，32:21.    2  Hoelzer D，Thiel E，Loffer H，et al. Prognostic factors in

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