实验三 苦参生物碱的提取与鉴识

1、实验三 苦参生物碱的提取与鉴识背景1.1苦参的化学成分苦参,又名苦骨(见本草纲目川)、川参(见贵州民间方药集、凤凰爪(见翌广西中兽医药植)、牛参(见湖南药物志),陶宏景谓:“叶极似槐叶,花黄色,子作荚,根味至苦恶。”李时珍谓:“苦以味名,参以功名。”lz始载于(神农本草经,列为中品。为豆科(Leg姗z'n口sae)植物苦参(叩加rafla。escensAz't.)的干燥根。分布于我国南北各地Is,春秋两季采挖,除去根头及小支根,洗净,干燥、或趁鲜切片,干燥。苦参性味苦寒,归心、肝、胃、大肠、膀肤经。功能清热燥湿、祛风杀虫、利尿通淋。用于热痢、便血、黄疽尿闭、赤白带下、阴肿阴痒、

2、湿疹、湿疮、皮肤癌痒、疥癣麻风等诸多病症。苦参中含有多种有效成分,目前已知的主要有生物碱类、黄酮类、挥发油类化合物,还含有少量醒类、皂试类及氨基酸等其它化合物。下面分别介绍各类化合物的主要成分。1.LI生物碱国内外学者从苦参根、苦参茎和叶及其花【4一l0中共分离出26种生物碱。苦参生物碱大多数是哇诺里西咤类(quinolizidine一type),极少数为双呱陡类(dipiperidine-tyPe)。喳诺里西陡生物碱多数为苦参碱型生物碱,另有两种金雀花碱型(eytisine一type)生物碱,两种无叶豆碱型(Sparteine一type)生物碱,一种羽扇豆碱型(lupinine一type)生

3、物碱。包括苦参碱(matrine),氧化苦参碱(oxymatrine),槐果碱(sophoearpine)、氧化槐果碱(N一oxysophoearpine)、异槐果碱(isosoph。Carpine)、异苦参碱(isomatrine)、7,11一去氢苦参碱(7,11一dehydromatrine)、槐胺碱(Sophoramine)、异槐胺碱(isosophoramine)、新槐胺碱(neosophoramine)、'3一去氢槐胺碱(3一dehydrosophoramine)、一去氢槐胺碱(7-dehydrosophoramine)、槐醇(sophoranol),9。一经基槐胺碱(9。一

4、hydroxysophoramine)、5。,9。一二轻基苦参碱(5。,ga一dehydroxymatrine)、氧化槐醇(sophoranolN一oxide)、雀花碱(lupanine)、臭豆碱(anagyrine)、膺靛叶碱(baptifoline)、Mamanine,Kuraramine、1sokuraramine等。1.1.2黄酮类化合物从苦参根和狭叶苦参根分离的黄酮类化合物己有29种ll,'2,多数为二氢黄酮和二氢黄酮醇类,少数为黄酮类、异黄酮类、查耳酮类和紫檀素类,其中仅有两种化合物为试,取代基除了常见的轻基、甲氧基外,多数化合物还具有异戊烯基(取代基A1.1.3挥发油成分

5、王秀坤等!4】对苦参中的挥发油成分进行了分析,采用苦参粗粉与水共蒸馏,乙醚处理,无水硫酸钠脱水干燥,回收乙醚得油状物,再经气相色谱、质谱分析,共鉴定出47个成分。鉴定出的化合物以二十烷烃为主成分,占58.12%。就结构类型看,以烯烃为主,其次为烷烃和醇类,尚含酸醛酮酚等。1.1.4其它类型的化合物从苦参根中还分离得到一系列2一烷基色酮的衍生物I5、一种醒类化合物和两种三砧皂试l6】。王秀坤等llvl对苦参中的游离氨基酸成分进行了分析与鉴定,鉴定出巧种氨基酸,并计算了各成分的含量。发现苦参中总游离氨基酸含量为162.51mg/l00ml,其中含量最高的为脯氨酸,107.51mg/l00ml,其次

6、为天冬氨酸29.64mg/100ml。张俊华等Is用色谱等方法分离,波谱等方法鉴定苦参中化学成分结构,分离得到5个化合物,分别为蔗糖、二十四碳酸、日一谷肖醇、芥子酸十六酷,伞形花内酷,均为首次从苦参中获得,其中芥子酸十六酷为新化合物。一.实验目的1.本实验通过从苦参中提取苦参生物碱，考察盐酸的浓度和渗漉速度对提取产率的影响2.了解化学反应萃取分离在天然药物提取过程中的应用掌握渗漉法和离子交换提取生物碱的原理、方法与工艺过程，并熟悉用柱层析法分离生物碱。二.实验原理利用苦参生物碱具有弱碱性，可与强酸结合成易溶于水的盐的性质，将总碱从药材中提取出来。结合动态连接提取工艺过程，实现生物碱充分溶出。然

7、后，加碱碱化，即可得到苦参生物总碱。渗滚法(percolation)的提取过程类似多次浸取过程,浸出液可以达到较高浓度,浸出效较好。此法常温操作不需加热,溶剂用量少,过滤要求较低,使分离操作过程简化,尤其适用于热敏性、易挥发且有效成分含量较低或贵重药材提取。采用0.5%的硫酸溶液对中药材黄连用渗辘法提取,收集7倍量渗媲液即可保证生物碱的提取率,与回流法比较,渗辘法提取物含杂质少、提取率高、使用溶剂量少即l。渗渡法的操作技术要求较高,否则会影响提取效率,当提取物为薪性、不易流动的成分时,不宜使用该法。三.实验流程鉴识:定性反应.薄层色谱等四.实验过程1.离子交换树脂的预处理将 70g 聚苯乙烯磺

8、酸型树脂(交联度3%)，放入烧杯中，加200ml 80的蒸馏水溶胀30 分钟，倾出蒸馏水后加入2mol/L 盐酸300ml，充分搅拌，放置半小时(静态转型)，后装入树脂柱(2cm×100cm)，并使全部酸水溶液通过树脂柱(动态转型)，流出液的速度以液滴不成串为宜。后用蒸馏水洗至中性，待用。注意从装柱到洗涤过程中始终保持液面高于树脂床。2.总生物碱的提取和分离（1）动态连续提取 取苦参粗粉200g加一定浓度的盐酸，拌匀，放置30min,使生药膨胀。 然后装入渗漉桶中，边加边压，层层加紧，全部装完后，药面压平，盖一层滤纸，滤纸上压一些洗净的玻璃塞。 加入一定浓度的HCl溶液经过药面，以4

9、5mL/min的速度渗漉，收集渗漉液至无明显的生物碱反应为止，收集渗漉液约2500mL。（2）交换 将收集的渗漉液置于阳离子交换树脂进行交换，如交换液有为交换的生物碱时，仍可以继续交换，直至流出液无生物碱反应为止。 将树脂倾入烧杯中，用蒸馏水洗涤数次，除去杂质，于布氏漏斗中抽干，倒入唐磁盘中晾干。（3）总生物碱的洗脱 将晾干的树脂，加浓氨水适量，搅匀，使湿润度适宜，树脂充分膨胀，盖好放置20min。 装入索氏提取器中，加三氯甲烷300mL在水浴上回流洗脱，提至尽生物碱为止。 回收三氯甲烷，得棕色粘稠物。 加无水丙酮适量，加热溶解，过滤，减压蒸干。必要时重复此操作，以脱除粗生物碱中的水，再在无水

10、丙酮中重结晶。3氧化苦参碱的分离（1）柱色谱法 取100目色谱用氧化铝50g，用漏斗缓慢加入色谱柱内（1cm×24cm，干法装柱），取苦参0.2g，加入适量氧化铝，搅匀，研细，装入色谱柱顶端，先用50ml三氯甲烷通过色谱柱，再用三氯甲烷-甲醇（9:1）洗脱，流速为1mL/min。每10mL为一份（约收集15份），经薄层层色谱鉴定，相同流出成分合并，在水浴上挥发去溶剂，剩余物加无水丙酮溶解，放置，析出结晶为氧化苦参碱。（2）溶解度差异法 将苦参总碱溶于少量三氯甲烷中，加入10倍量乙醚，放置后有沉淀析出，过滤吸出的沉淀，滤液浓缩后再溶于少量三氯甲烷中，加入乙醚放置，再过滤析出沉淀，合并两

11、次的沉淀物，用丙酮重结晶，即为氧化苦参碱。4.苦参生物碱的沉淀反应 取自制苦参总生物碱约 0.1g 加 1% 盐10ml 使溶解,过滤,取滤液分置于三支试管中,进行以下试验: (1)碘化铋钾试验:于上述一支试管中加入碘化铋钾试剂 12 滴,立即有桔红色沉淀产生 . (2)碘化汞钾试验:于上述另一支试管中加入碘化汞钾试剂 23 滴,有白色沉淀产生. (3)碘碘化钾试验 : 于上述第三支试管中加入碘一碘化钾试剂 23滴,有褐色或棕褐色沉淀产生.5苦参生物碱的薄层层析鉴定(1)氧化铝薄层层析法 吸附剂:中性氧化铝(级,过 160 目筛),干法铺板(软板). 样品: a. 自制苦参碱乙醇溶液; b.

12、苦参碱标准品乙醇溶液; c. 自制氧化苦参碱乙醇溶液; d. 氧化苦参碱标准品乙醇溶液; e. 自制苦参总生物碱乙醇溶液 展开剂: 氯仿甲醇 (19:1) 展开三次; 氯仿甲醇浓氨水(5:0.6:0.2) 显色剂:喷雾改良碘化铋钾试剂,观察斑点颜色,并与标准品对照(2) 硅胶薄层层析法 吸附剂:2%氢氧化钠溶液制备的硅胶 G 硬板,于 110烘干半小时. 样品:同 (1) 项下 展开剂: a. 先以甲苯乙酸乙酯甲醇水(2:4:2:1) 展开,展距约 8cm, 取出,晾干,再以甲苯丙酮乙醇浓氨试液(20:20:3:1)展开,展距第一次相同; b. 氯仿甲醇乙醚(44:0.6:3) 显色剂:喷雾改

13、良碘化铋钾试剂和亚硝酸钠乙醇液,观察斑点颜色,并与标准品对照五.思考题1. 叙述酸水法及离子交换法提取纯化生物碱的原理。2. 应如何检查(1) 渗漉液中是否含有生物碱？(2) 渗漉液中生物碱是否被交换在树脂上？(3) 离子交换树脂是否已饱和？3. 简述索氏提取器提取原理及特点。4. 在收集渗漉液的过程中，溶液的颜色有何变化？在回流提取中，有何现象发生？5.制备性薄层色谱的特点是什么？六.主要参考文献1.胡晶红，苦参生物碱的提取和氧化苦参碱的纯化，山东大学硕士学位论文，20072. AUeno et alChemPharmBull1978，26，18323.陈德昌中药化学对照品工作手册北京：中国

14、医药科技出版社，2000：1424.杨云等天然药物化学成分提取分离手册北京：中国中医药出版社，2003：454另外的方案1.4.1.2浸渍浸渍法(maceration)可在常温或加热的条件下浸泡药材获取有效成分,操作简单易行,但所需时间长,溶剂用量大,有效成分浸出率低。常温浸渍是较为常用的生物碱提取方法,如秦学功等圈考察了苦豆子种子中生物的冷浸工艺条件,室温下用稀盐酸提取苦豆籽中的苦参总生物碱,研究不同条件下的总碱浸出率,最高可达3.7%以上。陈月圆等Ivol以小聚碱为指标,对黄柏中的总生物碱提取方法进行了优化,分别用水、乙醇和酸作为溶剂,使用乙醇为溶剂的提取率为84.4%,远高于其它两种溶剂

15、。1.4.1.3回流回流法(circumfluence)是以乙醇等易挥发的有机溶剂为溶媒,对浸出液加热蒸馏,其中挥发性溶剂馏出后再次冷凝,重新回到浸出器中继续参与浸取过程,多采用索氏提取器完成。此法操作简便,提取率较高。龙德清等Ivll用酸性醇回流法提取魔芋中总生物碱,得到最佳的工艺条件为在pH值2一3的酸性醇中回流3h,总生物碱含量为0,39%。回流法操作时间较长,且整个过程处于加热状态,不适用于热敏性生物碱的提取。1.4.1.4渗流渗滚法(percolation)的提取过程类似多次浸取过程,浸出液可以达到较高浓度,浸出效果较好。此法常温操作不需加热,溶剂用量少,过滤要求较低,使分离操作过程

16、简化,尤其适用于热敏性、易挥发且有效成分含量较低或贵重药材提取。采用0.5%的硫酸溶液对中药材黄连用渗辘法提取,收集7倍量渗媲液即可保证生物碱的提取率,与回流法比较,渗辘法提取物含杂质少、提取率高、使用溶剂量少即l。渗渡法的操作技术要求较高,否则会影响提取效率,当提取物为薪性、不易流动的成分时,不宜使用该法。1.4.2生物碱提取新技术随着科学的发展,针对传统提取过程中存在的能耗大、有效成分损耗大杂质较多、效率较低等问题,一些新技术应用于生物碱提取工艺中,在传统方法的基础上利用新技术的强化作用或流体在超临界状态下进行萃取大大提高了提取效率,降低了过程能耗,因其显著优势而成为研究热点。1.4.2.

17、1超声辅助提取超声辅助提取(ultrasound一assistedextraetion,UAE)的3个理论依据是超声波热学机理、超声波机械机制和空化作用侧。利用超声技术可以缩短提取时间、提高提取率,并且无需加热,提高了热敏性生物碱的提取率且对其生理活性基本没有影响,溶剂使用量相对较少,可以降低成本。郭孝武曰】对比研究了超声、回流和浸泡3种方式提取益母草中总生物碱的产率,超声可以使益母草茎组织形态结构发生变化,造成茎内组织细胞损伤,促使益母草总生物碱快速提取,缩短了提取时间。超声提取4Omin比回流提取Zh产率高42.86%,而所得总生物碱无化学结构改变。国外对于超声提取生物碱也有研究,A.pj

18、ilani等175】利用超声技术在不同溶剂系统中提取阿托品(atropine),得到最有效的提取溶剂系统为CH30H/CH3CN(80:20),提取率为1.01%。1.4.2.2微波萃取微波萃取又称微波辅助提取(mierowave一assistedextraCti。n,MAE),利用介电损耗和离子传导的原理,根据不同结构物质吸收微波能力的差异,对某些组分选择性加热,可使被萃取物质从体系中分离进入萃取剂附l。郭锦棠等脚l对微波与索氏回流方法提取生物碱进行了研究,发现联合微波与索氏提取法对黄连中盐酸小聚碱的提取效果优于单独索氏提取。高姗vs利用微波萃取,采用正交试验优化了十大功劳叶中小璧碱的提取条

19、件。Feizhang等f79对比不同方法提取博落回(Macleayaeordata(wsnd)R.Br.)中的血根碱和白屈菜赤碱,得出微波萃取比浸渍、超声辅助提取等更为有效。相对于传统方法,微波萃取质量稳定、产量大,选择性高、节省时间且溶剂用量少、能耗较低。但微波萃取受萃取溶剂、萃取时问、萃取温度和压力的影响,选择不同的参数条件,往往得到不同的提取效果。1.4.2.3超临界流体萃取超临界流体萃取(Supercriticalfluidsextraetion,SCFE)是20世纪90年代发展起来的一项新型提取技术,利用超临界流体(SupercritiCalfluids,SCF)为萃取剂,从液体或固

20、体中萃取目标组分。SCF特有的理化性质s0l“使其具有比液体溶解能力大、比气体易于扩散和运动且传质速率远高于液相过程的特点,目前普遍采用的SCF为C02。超临界流体萃取具有以下优势:(1)萃取率高;(2)选择性高,分离彻底;(3)工艺简单,操作费用低;(4)操作温度低,适于热敏性物质提取;(5)COZ无毒、不易燃,安全性高且价格低廉。目前利用超临界流体萃取技术提取天然成分已成为研究热点。张立伟等sz利用超临界coZ流体萃取苦参中的总生物碱,提取率为常规方法的2.4倍,耗时为常规方法的1/3。LiuB等1831从防己科植物青藤中用超临界coZ流体提取汉防己碱,在萃取过程中是否加入甲醇改性剂的提取

21、率差别巨大,分别为7.47mg/g和0.17mg/g。1.5生物碱的纯化方法概述经过溶剂提取后的生物碱溶液除生物碱及盐类之外还存在大量其它脂溶性或水溶性杂质,需要进一步纯化处理,将生物碱成分从中分离出来。通常使用的是有机溶剂萃取、色谱和树脂吸附,随着新技术如分子印迹、膜分离技术的发展和应用,大大简化了过程、提高了纯化效率。1.5.1有机溶剂萃取有机溶剂萃取(organieSolventextraetion)是利用提取物中各成分在两种互不相溶的溶剂中分配系数不同达到分离的方法,萃取时组分在两相溶剂中的分配系数越大分离效率越高,分离效果越好。对于亲脂性生物碱,利用非极性和低极性有机溶剂如苯、乙醚、

22、氯仿等与水进行液液萃取;对于水溶性生物碱,利用极性较大的有机溶剂如乙酸乙酷、丁醇等与水溶液萃取。有时可用多种溶剂配制成两相互不相溶的溶剂进行萃取s'。有机溶剂萃取是生物碱纯化的经典技术,应用广泛,具有操作简单、容易放大的优点,但分离效率和纯度较低,使用大量有机溶剂,操作安全性不佳。1.5.2色谱分离色谱法(chrolnatography)也称层析法,是一种物理分离方法,可以用于分离纯化和鉴定中药有效成分。色谱法包括纸色谱、薄层色谱和柱色谱,其中常用吸附柱色谱纯化生物碱成分,一般使用吸附剂为硅胶和氧化铝。1.5.2.1硅胶柱色谱利用5102·xH20作为吸附剂,约90%以上的分

23、离纯化工作均可使用此法。硅胶是中性无色颗粒,性能稳定,分离效率与其粒度、孔径及表面积等因素1.4.1.1煎煮煎煮法(dec0Ction)是中药最早、最常用的制剂方法之一,适用于有效成分能溶于水,且对加热不敏感的药材,能够提取出相对较多的有效成分。黄际薇等脚采用酸水煎煮,以苦参碱和氧化苦参碱的提取率为指标,用正交试验法优选了山豆根的提取工艺。M.G.ortega等!0sl考察了使用煎煮法从石松属药材植物HuperziaSaururus中提取生物碱,取809干燥粉碎后的药材,用600ml沸水煎煮2次,每次时间为lh,合并提取液后碱化,然后用氯仿萃山东大学硕士学位论文有关1851。硅胶柱色谱使用范围

24、广,可作为极性和非极性生物碱的纯化,成本低、操作方便。张兰兰等186研究了钩吻总生物碱中钩吻素子的提取与分离,经过溶剂回流提取后,用碱性硅胶柱层析分离钩吻素子取得了很好的效果。1.5.2.3氧化铝柱色谱以A12仇作为吸附剂的层析分离法,根据氧化铝制备和处理方法差异,分为碱性、中性和酸性3种,其中碱性和中性的氧化铝适用于分离酸性较大、活化温度较高的生物碱类成分。有文献报道粉防己生物碱经粗提后用A12仇层析方法正向分离非酚性粉防己碱与粉防己诺林碱有较好的效果187。需要注意的是A1203的粒度对分离效率有显著影响,一般粒度范围在100160目,低于100目则分离效果差,高于160目则溶液流速太慢。

25、1.5.3树脂吸附树脂吸附包括离子交换树脂(ion一exchangeresin)和大孔树脂(macro一porousresin)。树脂吸附摆脱了传统纯化法得到的制剂大、黑、粗,使用不方便且溶剂用量大的缺点,因其具有的诸多优势而成为应用日益广泛的纯化技术。1.5.3.1离子交换树脂离子交换树脂主要通过静电引力和范德华力选择吸附,根据本身特性分为多种类型。针对生物碱的性质选用强酸型阳离子交换树脂,将酸化的生物碱提取液通过树脂,使生物碱盐的阳离子交换到树脂上而与其它成分和杂质分离。经过离子交换后的树脂用氨水碱化得到游离态生物碱,等树脂晾干后根据生物碱的亲脂或亲水性质用相应的溶剂进行提取得到总生物碱。

26、王洪新等lss分别用动态法和静态法筛选离子交换树脂用于纯化苦豆子中的生物碱,考察了pH值、助溶剂等因素对纯化效果的影响,对苦参生物碱生产具有指导意义。1.5.3.2大孔树脂大孔树脂是在离子交换树脂基础上,自20世纪60年代初开发出的一类新型高聚物吸附剂,其纯化机理是利用特殊吸附剂一一大孔树脂的吸附性和分子筛结合的原理,选择性吸附中药提取液中有效成分,去除杂质。树脂经过洗脱、浸泡、冲洗等过程处理后再生可重复使用。目前多数生物碱成分的纯化都可采用此技术,相对于盐析、沉淀等传统技术,大孔树脂吸附具有以下山东大学硕士学位论文3个优点:(l)溶剂用量少;(2)产品质量高,稳定性好;(3)生产周期短、设备

27、简单。这些优良的性能使大孔树脂吸附在近年来受到越来越多的关注1501。聂其霞等100比较了醇沉、大孔树脂吸附和吸附澄清3种方法对黄连解毒汤中小巢碱含量的影响,发现大孔树脂法为最佳的纯化方法。1.5.4分子印迹分子印迹技术(moleeularimprintingteehnology,MIT)是20世纪末出现的一种高选择性分离技术,通过印迹、聚合、去除印迹分子3步制备分子印迹聚合物(MIPs),以其特定的分离机理而具有极高的选择性,可以作为高度专一的固相萃取材料0ll。黄晓冬等脾】制备了辛可宁(cinchonine)分子印迹聚合物手性整体柱,可在Zmin内实现非对映异构体辛可宁和辛可尼丁(cinchonidine)分离。目前MIT分离生物碱的技术尚属研究阶段,需要在热力学及动力学性质、MIPS制备、降低成本等方面作进一步探索。1.5.5膜分离膜分离技术(membraneseparationtechnology,MST)是一项新兴的高效分离技术,分离过程以选择透过性膜作为分离介质,通过在膜两侧施加某种推动力(如压力差、化学位差、电位差等),使原料液中组分选择性通过膜。以压力差为推动力的膜分离过程包括微滤、超滤、纳滤、反渗透,根据筛分原理使