他克莫司软膏对特应性皮炎皮损角质形成细胞Toll样受体2和4表达的影响

1、他克莫司软膏对特应性皮炎皮损角质形成细胞Toll样受体2和4表达的影响?420?北京大学(医学版)JOURNALOFPEKINGUNIVERSITY(HEALTHSCIENCES)Vo1.38No.4Aug.2006?论着?他克莫司软膏对特应性皮炎皮损角质形成细胞Toll样受体2和4表达的影响谢志强.,刘玲玲.,扬高云,朱学骏(1.北京大学第一医院皮肤性病科,北京100034;2.清华大学第一医院皮肤科)摘要目的:探讨Toll样受体(Tolllikereceptor,rI'LR)2和rI'LR4在特应性皮炎(atopicdermatitis,AD)发病机制中的意义及外用他克莫司

2、软膏(商品名,普特彼)对TLR2和TLR4表达的影响.方法:采用免疫组织化学法检测9例中至重度AD患者急性发作期炎性皮损与正常对照皮肤角质形成细胞TLR2和TLR4的表达,以及外用他克莫司软膏单一疗法治疗AD3周后rI'LR2和rI'LR4表达的变化.结果:免疫组化检测显示在正常皮肤基底层角质形成细胞胞膜散在表达TLR2和TLR4.TLR2和TLR4在AD急性发作期炎性皮损角质形成细胞胞膜及胞浆过度表达,以细胞膜表达为主,主要定位于基底层至颗粒层;他克莫司治疗3周后改善特应性皮炎皮损角质形成细胞的TLR2和TLR4表达,主要定位于基底或基底上层角质形成细胞膜.结论:正常角质形成

3、细胞表达的TLR2和TLR4是构成皮肤天然免疫系统的组成部分.AD角质形成细胞诱导性过度表达TLR2和TLR4与AD皮肤天然免疫炎症反应有关,外用他克莫司可通过直接或间接作用抑制角质形成细胞的TLR2和TLR4诱导性表达,从而抑制与TLR一细胞核因子KB(NFKB)信号转导和调控途径有关的AD皮肤天然免疫炎症反应.关键词皮炎,特应性;他罗利姆;受体,细胞表面中图分类号R758.23文献标识码A文章编号1671167X(2006)04-0420-04EffectoftopicaltacrolimusointmentonexpressionofToll-likereceptors2and4inle

4、sionalatopicdermatitisskinXIEZhiqiang,LIULingling,YANGGaoyun,ZHUXue-jun.(1.DepartmentofDermatology,PekingUniversityFirstHospital,Beijing100034,China;2.DepartmentofDermatology,TsinghanUniversityFirstHospita1)ABSTRACTObjective:ToinvestgatetheroleofT0lllikereceptor(TLR)2andTLR4inpathogenesisofatopicder

5、matitis(AD)andtheeffectoftopicaltacrolimusointmentonexpressionofTLR2andTLR4inlesionalADskin.Methods:ImmunohistochemistrywasemployedtostudytheexpressionofTLR2andTLR4innornlalskinandlesionalADskinbeforeandafterusingtopicaltacrolimusointment.Resuits:Thebasalkeratinocytesinnormalskinconstitutivelyexpres

6、sedTLR2andTLR4.Incontrast,lesionalep.idermisfrom9patientswithacuteADoverexpressedTLR2andTLR4onthewholeepidermiskeratino.cyteswithmembranousandcytoplasmicstainingpattern.Atierusingtopicaltacrolimusointmentforthreeweeks.TLR2andTLR4wereexpressedonbasalandsuprabasalkeratinocyteswithmembranousandcyto.pla

7、smicstainingpattern.Conclusion:ThesedatasuggestthatTLR2andTLR4expressedbyepidermalkeratinocytesconstitutepartoftheinnateimmunesystemoftheskin.andincreasedTLR2andTLR4ex.pressionmayberelatedtotheskininnateimmuno.inflammatoryresponseinatopicdermatitis.Topicalta.crolimusmaydirectlyorindirectlyinhibitord

8、ownregulateTLR2andTLR4expressioninKCandinhibitskininnateimmuno.inflammatoryresponserelatedtoTLR.NFKBsignaltransductionandregulationinatopicdermatitis.KEYWORIDSDermatitis,atopic:Tacrolimus;Receptors,cellsurface特应性皮炎(atopicdermatitis,AD)是一组具有遗传倾向的,与特应性有关的并且伴有表皮异常性改变的湿疹样皮肤病¨.基础研究显示除T细胞及其介导的免疫炎症反应外

9、,角质形成细胞也是参与AD发病机制的重要细胞¨.角质形成细胞可在各种刺激下活化并产生多种生物活性分子.近年发基金项目:教育部教育振兴行动计划特殊专项("九八五"工程)资助SupposedbySpecialFundforPromotionofEducation,MinistryofEducationP.R.CCorrespondingauthor'Semail.zhuxj.ca谢志强,等他克莫司软膏对特应性皮炎皮损角质形成细胞Toll样受体2和4表达的影响现角质形成细胞可以表达与天然免疫有关的Toll样受体(Tolllikereceptor,TLR)和防御素

10、J,表明位于环境界面的角质形成细胞不但是构成表皮的结构细胞,而且还是参与皮肤天然免疫炎症反应的关键细胞.他克莫司软膏(商品名,普特彼)是一种新型外用免疫调节剂.外用他克莫司可抑制AD皮肤炎症反应.最初的研究证明其作用机制主要是通过抑制钙调磷酸酶而抑制激活性T细胞的细胞核因子(nuclearfactorofactivatedTceHs,NFAT)的转录,继而抑制T细胞的活化及其介导的免疫炎症反应J.近年研究发现他克莫司还可以通过作用于天然免疫细胞(如树突状细胞,肥大细胞及角质形成细胞)而起作用J.我们以前的研究证实外用他克莫司可抑制AD皮损角质形成细胞胞核因子KB(nuclearfactorKB

11、,NFKB)核表达.TLR2和TLR4是与角质形成细胞的NFKB活化有关的重要信号受体.因此,我们观察外用他克莫司软膏对特应性皮炎角质形成细胞的TLR2和TLR4表达的影响并探讨其意义.1对象与方法1.1对象选择9例中至重度急性发作期AD患者,诊断符合Williams标准及Rajka等JAD严重程度分级标准.所有患者1周前未外用过皮质类固醇激素,4周前未系统接受过皮质类固醇激素,免疫抑制剂及光化学治疗.9例患者临床特征见表1.表1特应性皮炎患者特征CharacteristicofpatientswithatopicdermatitisPatientsAge(year)SexLesionArea

12、(%)IgE(IU/mL)33467l58.83888ll863593l6388370Eosinophil(%)Eczemaseverity1.2用药方法在AD皮炎部位外涂一薄层0.1%(质量分数,成人)或0.03%(质量分数,儿童)他可莫司(商品名:普特彼)软膏,每日2次,用药间隔1014h,疗程3周.研究对象(AD患者)均签署知情同意书.本实验获得北京大学第一医院伦理委员会批准(批准号2003临审第42号)及国家药品监督管理局批文许可(批号2003L01257).1.3临床疗效观察指标采用湿疹面积和严重程度指数(eczemaareaandseverityindex,EASI)作为I临床疗效

13、评估指标.1.4免疫组织化学选择并切取4例正常人皮肤(取自整形手术正常皮肤)及9例AD患者急性发作期皮损与治疗后同部位皮肤标本,包埋于最适切片温度复合物中,液氮速冻后移至一80冰箱保存用于冰冻切片.TLR2羊多克隆抗体和TLR4鼠单克隆抗体购于美国SantaCruzBiotechnology公司.链霉卵白素一过氧化物酶(streptavidinHRP,SP)免疫组化染色试剂盒购于北京中山生物技术有限公司.实验步骤按SP一9003Histostain一PlusKits产品说明进行操作.实验操作步骤如下:新鲜皮损包埋于最适切片温度复合物中,于液氮或一80冰箱保存.标本于冰冻切片机切片6m厚.4丙酮

14、固定10min,磷酸盐缓冲液(PBS)洗,5min×3.用3%(体积分数)过氧化氢孵育10min,消除内源性过氧化物酶的活性.PBS洗,5min×3.用于TLR2检测的冰冻切片于10%(体积分数)正常兔血清封闭(即室温孵育)10min,用于TLR4检测的冰冻切片于10%(体积分数)正常羊血清封闭(即室温孵育)10min,勿洗.滴加稀释一抗,4过夜.阴性对照:一抗为PBS.PBS洗,5min×3.滴加生物素标记二抗,37温孵育20min.PBS洗,5min×3.滴加辣根酶标记链霉卵白素,37温孵育20min.PBS洗,5min×3.DAB显色.自

15、来水充分冲洗,复染,封片.1.5统计学分析两样本均数比较采用t检验.采用SPSS11.058779868773669354436l7O52677mm一一;.加弘eeeeekknnnnaaanamm弘¨window,统仆软件包完成2结果Ej凡'报撕If'LI/LIlrPI'KINI;LN1,:ISIr,一IIIH_lEI:ES-,?l38-4u20062.1AI)忠者皮肤辱障缺所收集9删1)心者中8例患暂皮肤行,上不同性度十皮f88.9%.8,/9).!】皮肤屏障缺陷,提示住此组患者r¨j致病Nf-经_点从接触划激nr能是其弧要的炎症触发途径22他l其

16、司;向疗引AD的ICES影l向外尉0.1%或003%他川'葜司治疗3J割后的EASI假(5.3【-I-6.83)蔷低丁治疗前的EASI幢(3830±1686.P<OO1).口JJff疗后皮损着改善2.3D发孔ltgI莉川特征瘸州政变符合急或韭急陛朗皮炎改变.r表皮增牛,什海绵H水.皮浅层单一核细胞浸润外¨j他兜莫司软膏治疗3J甜后AI】常规病衄改变为增牛的表皮变薄.海绵水淌失.单?骸细胞浸润疆着减少24AD皮损与止常皮肤角质形成细1施rLR2表达及定协特征免疫组化检测娃示:常对照皮肤,.¨.2表达于基底层角质形成圳胞胞浆受胞聪.以胞浆为主f割

17、lA);:A1)急性发作芷损,'JI2过度辰迓于垫底层至颗粒层侑质形成细胞胞膜及胞浆.胞幞为主(IB):外川他克莫司轼膏淆疗3周后.R2主要文达下越底层盟基底【.J伯质1成fill!咆浆及胞膜,颗粒层搜棘细胞上丧选消失或散芷发达(1割】c)25AD皮_f=!与JE常皮肤舶质肜成胞lI.R4表达及定位特征免疫化榆测显;:庄II常x,J照皮肤,¨.R4表达于基底层角质形成细胞胞脱(圈);在AI)急发作期皮损,'l'lR4过虞占基底J至撷粒层角质形成细胞咆膜(1E):外用他妃其软膏治疗3心后,11R4主要轰丛于基底层坎基底上层侑质J成I胞胞膜,¨.R4颗粒

18、层硬细1弛【_层轰达消失或敞在发达(lF1一一.klrIlJ1?yl'l1f2lJ¨innomalk】¨lSI'×200?¨.kral【l¨,lI'1.1!?'fn-L.¨Ibe一I-llIln1SI',×21x).:(.k?+rH1Illx'hI'IR2n'l:-rtr?i111ISIx2(10.I)lk,mtlin,;wleT】t4olinn,rmal,SP.x!x:;kentliyl?IIR4叫.fI,efimI,al-¨¨2(1I.k

19、,-ratiB+I'LR4?n,rdnx!州图1特r性靶r曲丧T甬压肜成细抱I【ll2和1LR4击一土免蹙皇ll化坫44I,'igrelllllUlII)IHining''I兀RandPLR4inkeratin,c)IlJ(1F【llADkbelimd州imrrh-;ihn-¨ITLR足一r,f【圳微生物组分千u细胞成分的模式识别受体,通过'll别其配.|=激活MyD88一FKB信号转导途径介天然免疫应答及炎症反近年研究fili实角质J成细胞丧丛多种n1(如r1.R2和TllP;4)TII2体包括外源性配体(如金葡萄球菌的成份肽策特,真萧的f露

20、壤糖)硬内源体(如热休克篮70)rLi4体包括外源性体(如月多糖)和源性体(如HSP60).这些配体可通过TlR激活I?D88一NrKI信转导途径.儆活NFK删控的,与免崆和炎反有关的多种靶基因,参多种免疫炎症性疾痫的发病机制J此.R已成为对炎症性疾墒具_仃满在清疗意义的谢志强,等他克莫司软膏对特应性皮炎皮损角质形成细胞Toll样受体2和4表达的影响靶受体J.本研究发现外用他克莫司在抑制AD皮肤炎症反应的同时可抑制或下调表皮角质形成细胞的TLR2和TLR4诱导性过度表达.以前的研究发现AD患者皮肤对多种病原体特别是金葡萄球菌易感性增加¨,金葡萄球菌可导致AD皮炎发生或加重.新近研究证

21、实金葡萄球菌的成份肽聚糖可通过角质形成细胞的TLR2受体信号途径激活NFKB12J并促进IL一8及其他促炎细胞因子(如IL一1,IL-6,TNFot基因)表达.TLR4是LPS的受体,正常角质形成细胞表达CD14一TLR4复合体,LPS可通过TLR4激活角质形成细胞的NFKB并促使角质形成细胞分泌IL一1和IL一8¨.本研究发现AD表皮角质形成细胞过度表达的TLR2和TLR4则为其配体通过角质形成细胞的TLR激活NFKB提供了条件.因此,TLR2和TLR4虽然接受不同的特异性配体,但在介导角质形成细胞活化上具有协同作用.由TLR途径激活角质形成细胞的NFKB所释放的促炎细胞因子(如I

22、L一8,IL一1,IL-6,TNFot)直接参与或启动皮肤的天然免疫应答及伴发的炎症反应.由于这种炎症反应是细菌成分或类感染因子启动的炎症反应,并且主要是TLR依赖的表皮炎症反应,因此可视为是一种皮肤天然免疫炎症反应,推测这一反应直接参与了AD免疫发病机制.此外,TLR2和TLR4还识别组织细胞损伤释放的内源性配体(如HSPT0)和透明质酸分解产物等¨,并由此激活NFKB.因此,通过下调AD急性发作期皮损角质形成细胞的TLR2和TLR4过度表达,外用他克莫司不但可下调由外源性配体通过TLRNFKB信号转导途径介导的皮肤天然免疫炎症反应,而且还可能下调由内源性配体通过TLRNFKB信号

23、转导途径介导的皮肤天然自身免疫炎症反应.他克莫司可上调角质形成细胞的TGFB¨,而TGFB可抑制TLR表达_1,支持他克莫司可能通过间接机制调节TLR表达.有趣的是本研究结果显示外用他克莫司可抑制基底层以上的角质形成细胞的TLR2和TLR4诱导性过度表达,并不抑制基底层角质形成细胞的TLR2和TLR4组成性表达,提示外用他克莫司3周可能并不影响TLR2和TLR4在基底层角质形成细胞上介导的天然免疫功能,但长期应用的影响有待于进一步观察.因此,本研究结果提示AD免疫发病机制涉及由TLRNFKB介导的角质形成细胞参与的表皮天然免疫炎症反应机制,他克莫司可通过抑制角质形成细胞的TLR诱导性

24、过度表达而下调由TLRNFKB介导的角质形成细胞参与的皮肤天然免疫炎症反应.参考文献1LeungDYM,BoguniewiczM,HowellMD,eta1.NewinsightsintoatopicdermatitisJ.JClinInvest,2004,113:651657.2KoilischG,KalaliBN,VoelckerV,eta1.VariousmembersoftheTolllikereceptorfamilycontributetotheinnateimmuneresponseofhumanepidermalkeratincytesJ.Immulogy,2005,114:5

25、31541.3BraffMH,BardanA,NizetV,eta1.CutaneousdefensemechanismsbyantimicrobialpaptidesJ.JInvestDermatol,2005,125:913.4NovakN,KwiekB,BieberT.ThemodeoftopicalimmunomodulatorsintheimmunologicalnetworkofatopicdermatitisJ.ExpDermatol,2005,30:160164.5谢志强,刘玲玲,窦侠,等.特应性皮炎皮损角质形成细胞NFKB表达及外用他克莫司对其影响J.北京大学(医学版),20

26、04,36:4874906WilliamsHC,BurneyPG,HayRD,eta1.TheU.K.workingpar-tysdiagnosticcriteriaforatopicdermatitis.1.DerivationofaminimumsetofdiscriminatorsforatopicdermatitisJ.BrJDermatol,1994,131:383396.7RajkaG,LangelendT.GradingoftheseverityofatopicdermatitisJ.ActaDermVenereolSuppl(stockh),1989,144:1314.8Tak

27、edaK,KaishoT,AkiraS.ToilLikeReceptorsJ.AnnuRevImmunol,2003,21:335376.9OneiilLAJ.TherapeutictargetingofTolllikereceptorsforinflammatoryandinfectiousdiseasesJ.CurrOpinPharmacol,2003,3:396403.1OOngPY,OhtakeT,BrandtC,eta1.EndogenousantimicrobialpeptidesandskininfectionsinatopicdermatitisJ.NEnslJMed,2002,347:11511157.11BreuerK.KappA.WerfelT.Bacteralinfectionsandatopicder-matitisJ.Allergy,2001,56:10341041.12MempelM,VoelckerV,KoIlischG.eta1.Toilli