吗啡对大鼠离体工作心脏延迟性保护作用的实验研究

1、吗啡对大鼠离体工作心脏延迟性保护作用的实验研究              作者：王建堂 ，马增山，马胜军，杜心灵   【摘要】  目的 研究吗啡预处理对大鼠离体工作心脏缺血再灌注的延迟性保护作用，并探讨其机制。 方法 48只Wistar大鼠随机分为6组，每组8只，即对照组、吗啡组、纳络酮组、格列本脲组、吗啡+纳络酮组和吗啡+格列本脲组。腹腔注射给药24 h后，建立离体工作心脏模型，4 St.Thomas停搏液诱导心脏停搏30 min，复灌45mi

2、n。观察心脏缺血再灌注前后血流动力学恢复率、心肌酶及心肌超微结构的变化。结果 吗啡组的心排出量（CO）恢复率、左室发展压（LVDP）恢复率、左室压力微分（±dp/dtmax）恢复率及乳酸脱氢酶（LDH）漏出量均优于对照组（P0.05）；30 min缺血再灌注后心肌超微结构损伤明显减轻；纳络酮和格列本脲可以完全阻断吗啡的作用，而单独使用纳络酮或格列本脲对大鼠心脏不产生影响。 结论 吗啡预处理对缺血心肌可以产生延迟性保护作用，其作用与阿片受体和心肌细胞ATP敏感性钾通道（KATP通道）介导有关。 【关键词】  吗啡；延迟性心肌保护；钾通道；阿片受体Experiment Stud

3、y of Morphine Mediate Effect of Delayed Phase of Myocardial Protection in Isolated Working Rat Heart)Abstract: OBJECTIVE   To investigate morphine mediate effect of delayed cardioprotection in rat heart. METHODS  48 male wistar rats were randomly divided into 6 groups with 8 animals i

4、n each group. There are 0.9% sodium chloride,morphine,naloxone，glibenclamide，morphine+naloxone and morphine+glibenclamide，according to different groups were administered via intraperitoneal injection. 24 hours late, the heart arrested 30 minutes with 4 St.Thomascardioplegic solution infusion followi

5、ng 45 minutes normothermic reperfusion in the isolated working rat heart.The recovery of hemodynamic effects, release of myocardial enzymes and ultrastructure of myocardium were assessed before and after ischemia. RESULTS  Morphine pretreatment significantly improved the recovery percentage of

6、postischemic CO,LVDP and +dp/dt (P0.05).Meanwhile,a lower release of LDH and ultrastructural integrity of myocardium were observed in morphine group after reperfusion.The cardioprotection effects of morphine could be abolished by naloxone or glibenclamide. CONCLUSION  Morphine pretreatment can

7、induce a delayed phase of cardioprotection via opioid receptors and KATP channels.Key words：  Morphine; Delayed myocardial protection; Potassium channel; Opioid receptor短暂的心肌缺血可使心脏对随后更严重的缺血损伤产生较强的耐受能力，被称为心脏的缺血预处理（ischemic preconditioning, IPC）。IPC包括两个阶段：早期相为IPC后13 h；延迟相，又称为延迟性预处理，出现在IPC后2472 h1

8、。其发生机制目前研究尚不清楚。本实验应用大鼠离体工作心脏模型观察吗啡对心肌的延迟性保护作用，并探讨阿片受体及心肌细胞钾通道在此过程中的作用。1  材料与方法1.1  实验动物  健康雄性Wistar 大鼠，体重（260±20）g，由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供。1.2  实验方法  所有大鼠均于注射给药24 h后，采用20 %乌拉坦5 ml/ kg腹腔注射麻醉，开胸前5min腹腔注射肝素500 U/ kg，快速开胸取出心脏浸于4 Krebs-Henseleit（K-H液）缓冲液之中，迅速主动脉插管将心脏固定于离体心灌注装置，

9、用37含95% O2和5% CO2的K-H液逆行灌注。结扎双侧肺静脉，于左心耳开口并插入内径3 mm的喇叭卷口导管，并连接恒压贮液瓶，调整其高度控制左房负荷为10 mmHg(1.5 kPa)，通过心尖插入内径1 mm钩型管进入左心腔，并将左室插管连接压力换能器。心尖、右心耳和主动脉根部置心外膜电极。离体心脏行Langendorff灌注15 min后转为左心工作状态，主动脉负荷50 mmHg(7.5 kPa)。10min后阻断左房及主动脉并于主动脉根部灌注4 St.Thomas停搏液20 ml/ kg，停搏期间维持心肌温度为15，30 min后开放主动脉钳并行Langendorff灌注15 mi

10、n，然后恢复左心工作状态30 min。开放时出现室颤者于主动脉根部推注利多卡因1mg并加心脏按压至恢复窦性心律。1.3  实验分组  48只大鼠随机分为6组，每组8只： 对照组：腹腔注射0.9 %生理盐水； 吗啡组：腹腔注射吗啡（沈阳第一制药厂制造）0.3 mg/ kg； 纳络酮组：腹腔注射纳络酮（湖南益侨制药有限公司）3 mg/ kg； 格列本脲组：腹腔注射格列本脲（Sigma公司）0.3 mg/ kg； 吗啡+纳络酮组：注射吗啡0.3 mg/ kg前10 min注射纳络酮3 mg/ kg； 吗啡+格列本脲组：注射吗啡0.3 mg/ kg前30 min注射格列本脲0.3

11、mg/ kg。1.4  观测指标  1.5  统计学处理  所有数据以均数±标准差（±s）表示，采用SPSS 12.0软件进行统计分析，多组间比较应用方差分析，P0.05为差异有显着意义。2  结果2.1  血流动力学改变  缺血前各组间比较差异无显着性意义（P0.05）。复灌后左心工作10 min和30 min时吗啡组CO、LVDP、±dp/dt的恢复率优于对照组，余各实验组与对照组相比，差异均无显着性（P0.05）。见表1。2.2  心肌酶变化  缺血前LDH、

12、CK-MB值各组间差异无显着性（P0.05）。吗啡组在复灌后左心工作10 min、30 min时的LDH值低于对照组（P0.05），CK-MB各组在各时点均无统计学差异。见表2。2.3  心肌超微结构改变  对照组、纳络酮组、格列本脲组、吗啡+纳络酮组和吗啡+格列本脲组心肌细胞肌丝排列紊乱、局部肌丝溶解、断裂；线粒体肿胀，嵴排列紊乱、稀疏断裂，可见空泡变性，部分线粒体膜破坏；细胞核固缩，染色质边集，核周有积液；糖原颗粒消失。吗啡组心肌肌丝排列基本整齐，局部肌丝排列紊乱、肌纤维收缩，肌浆网呈空泡状；线粒体轻度肿胀，部分嵴排列紊乱、少量断裂；细胞核基本正常，核仁明显，染色质基本

13、正常；有少量糖原颗粒。         表1   缺血后血流动力学恢复情况（略）注：与对照组比较*P0.05;*P0.01表2  缺血前后心肌酶值改变情况（略）注：与对照组比较 *P0.053  讨论   本研究应用大鼠离体工作心脏模型，采取与临床心脏外科手术相似的处理过程，观察到：吗啡明显改善了大鼠的心脏功能，LDH释放减少，心肌超微结构损伤轻，发挥了延迟性心肌保护作用。吗啡预处理前给予阿片受体阻滞剂纳络酮和KATP通道阻滞剂格列本脲可使吗啡的心肌保护作

14、用消失。单独使用纳络酮或格列本脲对大鼠心脏不产生影响。   阿片受体在体内分布广泛，不仅存在于中枢神经系统，而且在心脏、肾上腺髓质、血管、消化道、肾脏等外周组织存在。阿片受体包括、型，型又分为1、2两种亚型。吗啡作为一种非选择性的阿片受体激动剂，一般认为吗啡对型受体有高度亲和力，但吗啡也能与、受体相互作用。研究发现心肌缺血前24 h给予选择性-阿片受体激动剂，可以显着降低大鼠心肌梗死的面积2，本研究结果表明吗啡预处理产生了延迟性心肌保护作用，纳络酮能够拮抗其心肌保护作用，表明吗啡的心肌保护作用与激活阿片受体有关。目前认为延迟预处理对心肌组织的保护作用与蛋白质合成和（或）翻译

15、后修饰有关，内源性或外源性阿片样物质作用于相应的阿片受体，激活细胞内化学信号转导，目前研究比较肯定的信号转导途径有蛋白激酶C（PKC）、酪氨酸蛋白激酶（PTKs）、促丝裂原活化蛋白激酶（MAPKs）等途径，最终导致核因子- B（NF- B）、信号传导与转录活化因子（STATs）活化，多种心肌保护基因转录，合成心肌保护蛋白，如诱导性一氧化氮合酶（iNOS）、环氧化酶-2（COX-2）3、超氧化物歧化酶（SOD）、醛糖还原酶、热休克蛋白（HSPs）等，这些蛋白质的表达在延迟预处理后1224 h出现，持续34天并逐渐衰减，与延迟相发生的时间相一致，而且有证据表明KATP也参与介导了延迟性保护作用4-

16、5。   KATP通道是心肌细胞普遍存在的离子通道。本研究发现格列本脲完全阻断了吗啡的延迟性心肌保护作用，提示阿片受体激活可以引起KATP通道活化开放。KATP通道介导心肌保护作用的机制有以下几个方面：减轻细胞内Ca2+超载，减少缺血心肌的能量消耗。Ca2+稳态的保持在IPC的保护作用中具有重要地位，Ca2+超载是引起细胞损伤的重要原因之一6。心肌细胞膜上KATP通道开放导致Ca2+通道关闭，K+外流增加，复极加快，动作电位时程缩短，平台期Ca2+内流减少；较低的静息电位易于通过Na+/Ca2+交换排出细胞内Ca2+，从而使心肌细胞内Ca2+水平降低，缺血心肌收缩力减弱，A

17、TP消耗减少。减少氧自由基的形成。KATP通道开放使缺血心肌的过氧化物释放减少7，从而减低氧自由基对心肌收缩力以及冠状动脉血流量的抑制作用，减轻再灌注时氧自由基对心肌的有害作用。 抑制心肌细胞凋亡。PKC激活剂与P38 MAPK激动剂产生的效应可被KATP通道阻断剂所阻断8，而MAPK的激活被认为是IPC抑制心肌细胞凋亡的核心机制。   心肌细胞上存在两种KATP通道，分别位于心肌纤维膜（sarcKATP通道）和线粒体膜（mitoKATP通道）上。在IPC介导的延迟性心肌保护作用中sarcKATP通道仅发挥触发剂作用9，在阿片受体介导的延迟性心肌保护作用中，mitoKATP

18、通道发挥终末效应器作用10-11。这两种KATP通道在参与心肌保护过程作用相互补充，但两者的具体作用和机制尚存在争议12，有待进一步探讨。【参考文献】  1 Gross GJ. Role of opioids in acute and delayed preconditioningJ. J Mol Cell Cardiol, 2003, 35(7): 709-718.2 Patel HH, Fryer RM, Gross ER, et al. 12-lipoxyenase in opioid induced delayed cardioprotection: gene array,

19、mass spectrometric, and pharmacological analysesJ. Circ Res, 2003, 92(6): 676-682.3 Patel HH, Hsu AK, Gross GJ. COX-2 and iNOS in opioid-induced delayed cardioprotection in the intact ratJ. Life Sciences, 2004, 75(2): 129-140.4 Stein AB, Tang XL, Guo Y, et al. Delayed adaptation of the heart to stre

20、ss: Late preconditioningJ. Stroke, 2004, 35（11 suppl 1）: 2676-2679.5 Peart JN, Gross ER, Gross GJ. Opioid-induced preconditioning: Recent advances and future perspectivesJ. Vascul Pharmacol, 2005, 42(5-6): 211-218.6 Zucchi R, Ronca F, Ronca-Testoni S. Modulation of sarcoplasmic reticulum function: a

21、 new strategy in cardioprotectionJ. Pharmacol Ther, 2001, 89(1): 47-65.7 Raphael J, Drenger B, Rivo J, et al. Ischemic preconditioning decreases the reperfusion-related formation of hydroxyl radicals in a rabbit model of regional myocardial ischemia and reperfusion: the role of KATP channelJ. Free Radic Res, 2005, 39(7): 747-754.8 Yue Y, Qin Q, Cohen MV, et al. The relative order of mKATPchannel