土霉素对酶催化产物的荧光猝灭机理研究及其测定

1、第28卷第3期分析测试学报Vol128No132009年3月FENXICESHIXUEBAO(JournalofInstrumentalAnalysis)353356土霉素对酶催化产物的荧光猝灭机理研究及其测定张苗,岳宁宁,吕庆銮,宫斌,王怀友(山东师范大学化学化工与材料科学学院,山东济南250014)摘要:酪氨酸在辣根过氧化物酶催化下被H2O2氧化为强荧光物质S,土霉素对其荧光产生猝灭作用,根据Stern-Volmer方程和荧光寿命研究发现土霉素对产物S的荧光猝灭为静态猝灭。实验得到土霉素与强荧6光物质S反应的形成常数K=1193×10L/mol(25),结合点数n=1195。反应

2、热力学参数G<0,H>0,说明该反应是自发的吸热过程。根据荧光猝灭原则建立了测定土霉素的新方法,土霉素质量浓度在51608010mg/L范围内与IF/IF呈线性关系,线性相关系数为019968,检出限为0190mg/L,相对标准偏差0为0173%。关键词:辣根过氧化物酶;荧光猝灭;土霉素;热力学参数中图分类号:O65713;R978114文献标识码:A文章编号:1004-4957(2009)03-DeterminationofOxytetracyclineBasedtheofEnzyme2catalyzedZHANGMiao,YUENing2ning,2in,WANGHuai2yo

3、u(CollegeofChemistry,ChemicalMNormalUniversity,Jinan250014,China)Abstract:oxytetracycline(OTC)couldquenchthefluorescenceoftyrandH2O2undertheenzyme2catalyticreactionofhorseradishper2onamethodforthedeterminationofOTCwasdeveloped.AccordingtotheStern-merplotandthefluorescencelifetime,thefluorescencequen

4、chingwasconfirmedtobeastaticone.Resultsshowedthatthebindingconstant(K)andthenumberofbindingsites(n)obtainedfromthereactionofOTCwithsubstanceSwere1193×10L/mol(25)and1195,respectively.Thereactionthermodynamicparameters(G<0,H>0)indicatedthatthereactionwasaspontane2ousendothermicprocess.Thequ

5、enchedfluorescenceintensityofsubstanceSwasproportionaltotheconcentrationofOTCovertherangeof5160-8010mg/Lwithacorrelationcoefficientof019968.Thedetectionlimitandtherelativestandarddeviationwere0190mg/Land0173%,respectively.Keywords:horseradishperoxidase;fluorescencequenching;oxytetracycline;thermodyn

6、amicpa2rameters6土霉素为四环类抗生素,属广谱抗菌药,可作为预防和治疗畜禽疾病的兽药或作为促进畜禽生长1的饲料添加剂而广泛应用于可食性动物中。因其良好的杀菌、抑菌作用被用于防治动物和水产品的2疾病感染,但在发挥药效的同时对动物体有较大的毒副作用。因此,研究土霉素与生物分子的结合机理及土霉素含量的检测,对确保用药安全具有重要的实际意义。目前,土霉素的研究和测定方法主要有高效液相色谱法、紫外可见分光光度法、电化学方法等。荧光分析法因其灵敏度高、选择性好等优点被应用于化学、药学、生命科学等领域。关于土霉素的荧光测定方法报道较少,本文采用荧光光度法对土霉素进行了测定。8辣根过氧化物酶(H

7、RP)是从植物中提取的一种重要的酶制剂,被广泛应用于生物工艺技术、生物传感器9-103-567、有机合成11等领域。已有报道酪氨酸在辣根过氧化物酶催化下被H2O2氧化为强荧光12物质(产物S),反应方程式如图1所示。实验研究了土霉素对产物S的荧光猝灭机理,并根据荧光猝灭原则建立了测定土霉素的新方法。收稿日期:基金项目:第一作者:通讯作者:2008-09-18;修回日期:2008-10-26山东省自然科学基金资助项目(Y2006B31)张苗(1980-),女,山东潍坊人,硕士研究生王怀友,TelE-mail:wanghuaiyousdnu1edu1cn354分析测试

8、学报第28卷1实验部分111仪器与试剂FLS2920荧光分光光度计(Edinburgh,英国)可用于荧光寿命的测定;LS250荧光分光光度计(Perkin-El2mer,美国);pHS23C型酸度计(上海雷磁仪器厂);Di2rect2Q3(Millipore,美国)超纯水系统;YXCS型超级数显恒温器(山东鄄城永兴仪器厂)。土霉素(化学对照品,纯度9214%,中国药品生物制品检定所);L2酪氨酸(生化试剂,上海试剂厂);辣根过氧化物酶(HRP,酶活性为250330U/mg,酶的纯度为310);土霉素片(山东金洋药业有限公司);其他所用试剂均为分析纯。土霉素标准储备液(800mg/L);HRP溶

9、液(100mg/L);L2酪氨酸溶液(400mg/L逐级稀释至所需浓度,均于4下避光保存。H2O2溶液(01。pH815的Tris(三羟甲基氨基甲烷)-HCl缓冲溶液。图1反应方程式Fig11Thereactionequation土霉素片样品溶液的制备:取本品6片,研细,10100mL水,超声处理50min,离心,取上层清液转移到100mL,作为待测试样。112实验方法准确移取018050mLH2O2、210mLpH815的Tris-HCl缓冲溶液于10mL摇匀,作为溶液A。另取同量的上述试剂于另一比色管中,35min后加入110,用水稀释至刻度并摇匀,作为溶液B。2211荧光猝灭光谱按照“1

10、12”步骤,绘制产物S加入土霉素前后的发射光谱,结果见图2。产物S的最大发射波长为400nm。土霉素存在下,产物S的荧光强度明显降低,表明发生了荧光猝灭。212荧光猝灭机理探讨荧光猝灭分为动态猝灭、静态猝灭及动态静态相结合的猝灭,猝灭关系可用Stern-Volmer方程描述。如果静态猝灭与动态猝灭同时存在,S-V曲线具有向上弯曲的非直线特征,并满1002足下列多项式:IF/IF=1+(KD+KS)cQ+KDKScQ,KD、KS分别为动态猝灭和静态猝灭常数,IF、IF分别为未加入猝灭剂和加入猝灭剂时的荧光强度,cQ为猝灭剂的浓度。本实验的线00性方程为IF/IF=017794+010244c,相

11、关系数为019968,S-V图为线性,所以土霉素对产物S的荧光猝灭不是动态猝灭与concentrationofoxytetracycline:3010mg/L静态猝灭结合的猝灭。0如果猝灭过程为动态猝灭,则满足Stern-Volmer方程:IF/IF=1+kq0cQ=1+KsvcQ,kq为猝灭过-1-1程的速率常数(单位Lmols),0为没有猝灭剂存在时荧光分子的荧光寿命,Ksv为Stern-1Volmer猝灭常数(单位Lmol),S-V方程呈线性。图2加入土霉素前(a)、后(b)产物S的发射光谱Fig12EmissionspectraofsubstanceSbefore(a)andafter

12、(b)addingoxytetracycline如果猝灭过程为静态猝灭,荧光强度降低是由于形成了非荧光化合物,则满足S-V方程:I/IF=1+KcQ,K为形成常数,S-V方程也呈线性。通过荧光寿命的测定可区分动态与静态猝灭。静态猝灭时,猝灭剂的存在不改变荧光分子的寿命;0而在动态猝灭情况下,猝灭剂的存在使荧光分子寿命缩短。即0/1=1时为静态猝灭,0/1=IF/IF0F时为动态猝灭。本实验中土霉素作为荧光猝灭剂,产物S的荧光寿命在加入土霉素前后无明显变化(图3和图4),表明产物S和土霉素之间发生静态猝灭。0=5136ns,1=5137ns,即0/11。14第3期张苗等:土霉素对酶催化产物的荧光

13、猝灭机理研究及其测定355213静态猝灭形成常数与结合点数对静态猝灭反应来说,那么荧光分子和猝灭剂之间可按下式反应12:nQ+BQn-B,Qn-B是猝灭的荧光分子,n在本文中荧光分子即产物S,Ka=c(Qn-B)/(cQcB)。00()是cB,则cB=c(Qn-B)+cB,cB是未反应的cBcB=IF/IF,IF和IF分别为荧光分子在猝灭分子存在和不存在时的荧光强度,那么IFIF)/IF=lgK+nlgcQ,K是猝灭分子与荧光分子的形成常数,n为结合点数。用0lg(IF-IF)/IF对lgcQ作图,直线斜率为n,截距为lgK,即得土霉素与产物S的形成常数K=1193×00010L/m

14、ol(25),结合点数n=1195,曲线的相关系数r=019914,为显著性相关。6214反应热力学参数根据vantHoff方程lnK=-H(RT)+SR,得到土霉素与产物S反应的热力学参数。其中H-1S求与S由lnK对T作图所得曲线的斜率(-HR)和截距(SR)求出,G由方程G=H-T得,见表1。G<0,H>0,说明反应是自发的吸热过程。升高温度有利于反应向产物的方向进行,这与表中形成常数显示的大小变化规律相符。T/K表1反应热力学参数Table1ReactionthermodynamicparametersK2913013113213331139214841646198215实

15、验条件的优化21511pH值的影响试验了pH(1101210)对体系荧光强度的影响,结果表(-1)(-1)(-1mol-1)-341244217126413×1066-36187×106-39171×106-42108×107-45136明,pH为810819时体系荧光强度稳定,故选择pH815的Tris-HCl缓冲溶液控制体系的pH值。21512H2O2用量与HRP加入量的影响按照“112”分析步骤,当H2O2加入量为0150mL时体系荧光强度最大,故加入0150mL01003(体积分数)的H2O2。当加入HRP(50mg/L)的体积大于0180mL时

16、,体系荧光强度最大且保持不变,所以实验时选择加入0180mL50mg/L的HRP。21513试剂加入顺序及反应时间的影响试验了试剂加入顺序对体系荧光强度的影响。实验表明,最佳加入顺序为HRP、酪氨酸、H2O2、缓冲溶液、土霉素。测定了不同反应时间对体系荧光强度的影响。室温下反应30min后,体系荧光强度趋于稳定,因此选择反应时间为35min。加入土霉素后荧光强度降低,5min后荧光强度达到稳定且保持不变,故加入土霉素6min后再进行测定。21514干扰离子的影响分析了常见离子对测定3010mg/L土霉素溶液的影响。相对误差控制在356分析测试学报第28卷±5%内。干扰离子以500mg

17、/L为起始质量浓度,如果存在干扰,降低干扰离子的质量浓度直至干扰+-+-2-3-消除。结果如下:K、H2PO4、Cl允许存在量500mg/L;Na、Ac、HPO4、PO4允许存在量400mg/L;NO3、SO4、Mg允许存在量250mg/L;CO3、HCO3与Ca允许存在量分别为200、150、1mg/L。-2-2+2-2+216工作曲线、精密度与检出限土霉素质量浓度在51608010mg/L范围内与IF/IF呈良好的线性关系,线性回归方程为c=40198IF/IF-31194,IF为产物S的荧光强度,IF为土霉素存在时产物S的荧光强度,c为土霉素的浓度,线性相关系数为019968。同一样品测

18、定11次,测得土霉素的平均质量浓度为30114mg/L,相对标准偏差为0173%。同法测定空白11次,测得检出限为0190mg/L。217样品分析与回收率实验分别取0150、110、310mL待测试样,测定土霉素的质量浓度,13果对照。测定3次取平均值,在置信度等于95%时,用Cochran检验,2异。样品分析与回收率结果见表2。表2Table2No123ProposedmethodUVspectrophot-1±01120170116/(mgL-1)7151±010815130456Found-1Recovery-1101015102010/(mgL61006100610

19、0)L/(mg161219172516)RSDs/%0162013421621037893参考文献:1马玉红,史海燕.土霉素研究概况J.青海畜牧兽医杂志,2007,37(4):45-46.2张美金,林峰,林海丹,等.饲料中四环素类药物含量的高效液相色谱测定J.分析测试学报,2007,26(6):918-920.3PATRICIAPM,SUANNER,FELIXGRR.DeterminationofoxytetracyclineintomatoesbyHPLCusingfluorescencedetectionJ.FoodChem,2008,17(1):212-218.4WANGLinling,

20、YANGHai,ZHANGChunwei,etal.Determinationofoxytetracycline,tetracyclineandchlorampheni2colantibioticsinanimalfeedsusingsubcriticalwaterextractionandhighperformanceliquidchromatographyJ.AnalChimActa,2008,619(1):54-58.5庞国芳,曹彦忠,张进杰,等.高效液相色谱法同时测定禽肉中土霉素、四环素、金霉素、强力霉素残留的研究J.分析测试学报,2005,24(4):61-63.6邱光成,高宏艳.紫

21、外分光光度法测定土霉素片中间体(颗粒)的含量J.黑龙江医药,2007,20(5):434-435.7张敏,程发良,姚海军.土霉素的电化学性质及其与DNA相互作用的研究J.分析测试学报,2007,26(5):634-637.8RYANBJ,CAROLAN,OFAGAINC.Horseradishandsoybeanperoxidases:comparabletoolsforalternativenichesJ.TrendsBiotechnol,2006,24(8):355-363.9XUShiyi,PENGBo,HANXiaozu.Athird2generationH2O2biosensorbasedonhorseradishperoxidase2labeledAunan