实时荧光定量PCR的研究进展及应用-

1、2007年4月第15卷第2期中国实验动物学报ACT A LABORAT ORIUM ANI M A LIS SCIE NTIA SINICA Apr.,2007V ol.15N o.2研究进展实时荧光定量PCR 的研究进展及应用许琰,丛,魏强(中国医学科学院中国协和医科大学实验动物研究所,北京100021【摘要】实时定量PCR (real 2time PCR 的应用范围非常广泛,包括mRNA 表达的研究、DNA 拷贝数的检测、单核苷酸多态性(S NPs 的测定等。由于传统的PCR 技术不能准确定量,使其在实际应用方面受到很大限制,因此,对PCR 产物进行准确定量,尤其是病毒性病原的动态监控,成

2、为迫切需要。【关键词】聚合酶链反应;核酸扩增技术;应用;病毒【中图分类号】R319.9【文献标识码】A 【文章编号】100524847(2007022*Development of R eal 2Time Polymerase Chain R eaction andIts Application .A R evie wX U Y an ,C ONG Zhe ,WEI Qiang(Institute of Laboratory Aniaml Sciences ,Chinese Academy of Medical Sciencesand Peking Union Medical C ollege

3、 ,Beijing 100021,China 【Abstract 】The traditional polymerase chain reaction (PCR technique played a very im portant role in detection of nuclearacids.Recently ,based on PCR ,the real 2time PCR that can quantitate the products of PCR have been developed and applied in various fields ,especially in de

4、tection of viral pathogens.In this review ,the real 2time PCR technique and its application will be introduced.【K ey w ords 】real 2time PCR ;Nuclear acids am plification techniques ;Application ;Virus基金项目中国CIPRA 项目,美国NIH 资助,项目号U19AI51915204。作者简介许琰,硕士研究生,从事实验动物病毒分子生物学研究工作。通讯作者魏强,教授,研究方向:实验动物病毒学。E 2ma

5、il :weiqiang0430s 聚合酶链反应(polymerase chain reaction ,PCR 技术是1985年问世的一项基因检测技术。由于PCR 简便易行、灵敏度高等优点,该技术被广泛应用于基础研究。但是,由于传统的PCR 技术不能准确定量,且操作过程中易污染而使得假阳性率高等缺点,使其在临床上的应用受到限制1。荧光定量PCR 方法是根据荧光共振能量转移(fluorescence res onance energy trans fer ,FRET 原理,设计相应的荧光标记核酸探针,通过PCR 反应对相应靶DNA 进行均相定性定量测定的技术,根据检测中所使用的荧光探针分类,目前

6、已经开发出T aqMan 、M olecular Beacon 、Scorpion 、LightCycler 、Single 2labeled probe 、Res onSense 、Angler 以及双链探针等相关技术。1原理Real 2time PCR 技术,是指在PCR 反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。PCR 反应过程中产生的DNA 拷贝数是呈指数方式增加的,随着反应循环数的增加,最终PCR 反应不再以指数方式生成模板,从而进入平台期。在传统的PCR 中,常用凝胶电泳分离并用荧光染色来检测PCR 反应的最终扩增

7、产物,因此,用此终点法对PCR 产物定量存在不可靠之处。在real 2time PCR 中,对整个PCR 反应扩增过程进行了实时的监测和连续地分析扩增相关的荧光信号,随着反应时间的进行,监测到的荧光信号的变化可以绘制成一条曲线。在PCR 反应早期,产生荧光的水平不能与背景明显地区别,而后荧光的产生进入指数期、线性期和最终的平台期,因此可以在PCR 反应处于指数期的某一点上来检测PCR 产物的量,并且由此来推断模板最初的含量2。为了便于对所检测样本进行比较,在real2time PCR反应的指数期,首先需设定一个荧光信号的阈值,一般这个阈值(threshold是以PCR 反应的前15个循环的荧光

8、信号作为荧光本底信号。如果检测到的荧光信号超过阈值被认为是真正的信号,它可用于定义样本的阈值循环数(Ct。Ct值的含义是:每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。研究表明,每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系,起始拷贝数越多,Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线,因此只要获得未知样品的Ct 值,即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。2各种荧光定量方法目前real2time PCR所使用的荧光化学方法主要有五种,分别是:DNA结合染色,水解探针,分子信标,荧光标记引物,杂交探针,它们又可分为扩增序列特异和非特异的检测两大类。扩增序列非特异性的检

9、测方法的基础是DNA 结合的荧光分子,如SY BR G reen等荧光染料3。Real2time PCR发展早期就是运用这种最简单的方法,在PCR反应体系中,加入过量SY BR G reen荧光染料,SY BR G reen荧光染料特异性地掺入DNA 双链后,发射荧光信号。荧光染料的优势在于它能监测任何dsDNA序列的扩增,不需要探针的设计,使检测方法变得简便,同时也降低了检测的成本。然而正是由于荧光染料能和任何dsDNA结合,因此它也能与非特异的dsDNA(如引物二聚体结合,使实验容易产生假阳性信号,但可以通过分析产物的熔点曲线来排除非特异扩增。扩增序列特异性的检测方法是在PCR反应中利用标

10、记荧光染料的基因特异寡核苷酸探针来检测产物,主要有以下几种。T aqMan探针是一段5端标记报告荧光基团(R,3端标记淬灭荧光基团(Q的寡核苷酸,其序列与模板DNA中的一段完全互补。报告荧光基团(R如FAM,TET,VIC,JOE,HEX,淬灭荧光基团为T AMRA(Q。当探针单独存在时,由于荧光共振能量转移的发生,R的荧光受到Q的淬灭。在PCR过程中,由于T aq DNA酶的523外切酶活性的作用,使探针的5端的R被切断,加大了与Q的距离而使荧光恢复4。另一种荧光探针single labeled probe technology与T aqMan技术类似。不同之处在于其寡核苷酸探针只有一个荧光

11、发射基团,该基团是有带有荧光素的铋螯合物构成,并标记在寡核苷酸探针的5端,而3末端具有2个碱基不与模板配对,以保证探针的稳定性。在游离的状态下铋螯合物发出的荧光比连接单链寡核苷酸时强,当探针退火与模板互补配对时,在DNA聚合酶的523外切酶的作用下,探针被切断铋螯合物发出较强的荧光信号,从而实现对目的基因的分析。分子信标技术由T yagi和K rammer提出。分子信标长约25个核苷酸,在空间结构上呈发夹型,由环茎杆组成。环序列与靶DNA序列互补,长约18 20个核苷酸,茎杆部分长约57个核苷酸,由G C 含量较高的与靶序列无关的互补序列构成。分子信标的5端标记报告基团,3端标记淬灭基团。当分

12、子信标处于自由状态时,发夹结构的两个末端靠近使F与Q靠近。F被淬灭。当有靶序列存在时,分子信标与靶序列结合,使分子信标的茎杆区被拉开。此时R荧光不能被淬灭,可检测到荧光。常用的荧光2淬灭分子对有C oumarin2DABCY L,E ADNS2 DABCY L,FAM2DABCY L,TET2DABCY L,T AMRA2 DABCY L,T exasRed2DABCY L等。建立在分子信标技术基础上的探针技术有Am plifluor,Sunrise, Am plisens or,Scorpion等5-7。其中Scorpion技术广泛应用。其设计为在分子信标的3端通过连接臂连接一段引物。扩增出

13、包含发夹结构的PCR产物。包含发夹结构的PCR产物在退火时形成分子内杂交,发夹结构被破坏,两个基团之间发生荧光共振能量转移,从而发出荧光。双链探针又称为复合探针,由互补的两条链构成8-9。长链的5端标记报告基团,3端磷酸化,短链的3标记淬灭基团。没有靶核苷酸存在时,两条链形成复合体,荧光被淬灭。当有靶序列存在时,带有报告荧光基团的长链探针先和靶结合,发出荧光。杂交探针与其他种类的探针相比比较容易设计,每段探针是单标记的。目前有三种设计形式10-14。探针探针形式:这种方式由两条相邻的探针构成,荧光供体标记在一条探针上,另一条相邻的探针标记一长波长的荧光受体分子。两条探针均与靶序列特异性结合,且

14、结合后的两条探针均与模板相结合,供受体荧光之间发生了FRET能量转移,可以检测到供体荧光强度的减弱,受体荧光强度的增强,供受体荧光基团之间的间距为1碱基时最为合理。在间距为510碱基时荧光信号强度降低50%,但在间距1525碱基时仍能检测出信号。引物探针形式:由一条单标记引物和一条单标记探针构成。标记引物可用于PCR扩增。距引物3端3 6个碱基的T碱基经过修饰可用于荧光染料的标记。另一条探针的3端标记相应的荧光可与荧光引物扩增出的链相杂交。在杂交时供体荧光基团和受体荧光基团在相反的链上相距46个碱基。G 淬灭探针形式:只用一条单标记的探针。在杂交时可以观察到荧光的增强或减弱。例如,在探针杂交时

15、FAM或BODIPY2F L在接近G核苷酸时可发生荧光淬灭15。这种探针可以在3或5端标记。探针设计成标记的荧光化合物与靶DNA上的G重合。靶DNA上相邻的G会增强淬灭的效果。但第一个位置重叠的G是最重要的。以上的杂交探针,5端标记者其3端必须磷酸化以阻止在PCR中链的延伸。在杂交探针中供体荧光基团可采用FAM、FIT C、受体可采用LC2RE D640、CY5、LC2RE D705。除以上各种荧光探针外,一些探针如Light2Up、Cyclicons、LUX见之报道16-18。从目前国内外的科研及临床应用情况来看,以T aqMan,分子信标, Scorpion以及杂交探针应用较为广泛。在国内

16、外已开发成功并投放市场的PCR检测试剂盒中,所运用的主要是T aqMan、分子信标以及杂交探针这三种技术。Scorpion是一种改进型的分子信标19。由于其工作原理是扩增后的单个分子内的杂交,因此有着更好的动力学和热力学特性。相比上述三种需分子间杂交的探针,Scorpion杂交速度极快,更适合快速热循环PCR。但是由于其合成的难度比较高,价格比较昂贵,限制了其广泛的应用。目前对T aqMan技术的改进也在进行中,Dmitri Proudinkov将淬灭剂从链3端移至链的中间,可以将灵敏度提高30倍以上。同时一种可以替代FAM的新的荧光染料Alexa Fluor488及非荧光和金属淬灭剂也已应用

17、于T aqMan技术,可使其灵敏度进一步提高。3实时荧光定量PCR技术的应用Real2time PCR的应用范围很广泛,包括mRNA 表达的研究、DNA拷贝数的检测、单核苷酸多态性(S NPs的测定等。以下就目前real2time PCR在易位基因的检测,细胞因子的表达分析,肿瘤耐药基因表达的研究以及病毒感染的定量监测中的应用作一概述。3.1微小残留病变的检测肿瘤疾病尤其是血液的恶性肿瘤常伴有特异性基因的易位,这种易位往往可以作为监测临床治疗效果的一种肿瘤标志。虽然在过去的几十年里治疗方案的改进已大大地延长了患者的生存期,但是缓解期的患者仍存在复发的危险性。因此微小残留病变(MRD的检测对于进

18、一步调整治疗方案是至关重要的。Real2time PCR的应用正成为检测肿瘤微小残留分子标志的一种必备的研究工具。通过对肿瘤融合基因的定量测定能指导临床对患者实行个体化的治疗。3.2细胞因子的表达分析细胞因子是调节蛋白,它通过调节免疫反应(包括淋巴细胞活化、增殖、分化、生存和凋亡在免疫系统中起着核心作用。许多不同类型的细胞都能分泌这种低分子量的蛋白质,其中包括淋巴细胞、抗原递呈细胞、单核细胞、内皮细胞和成纤维细胞。细胞因子可被分为不同的组:白介素(I L21I L223,干扰素(IFN2,IFN2等,集落刺激因子(CSF,肿瘤坏死因子(T NF,肿瘤生长因子(TG F2等和化学因子(MCP21

19、,MIP21等20。为了阐明在许多炎症反应、自身免疫性疾病和器官移植排异中的免疫致病途径,细胞因子mRNA表达谱的可靠定量是很重要的。尽管被检样本中细胞因子含量往往极低,然而real2 time反转录PCR(RT2PCR以其高敏感性和准确性在细胞因子的定量中越来越受到青睐。3.3肿瘤耐药基因表达的研究对化疗药物的耐药是治疗肿瘤患者的主要障碍。由于耐药限制了许多肿瘤的成功治疗,因此研究肿瘤细胞的耐药机制就变得十分重要。目前研究中发现主要的耐药机制有:ATP结合基因超家族(ATP2binding cassette superfamily的膜转运蛋白介导的耐药21,酶介导的耐药,凋亡基因介导的耐药等

20、22。多药耐药(MDR是多因素、多种机制共同作用的结果。Real2time反转录PCR(RT2PCR是了解肿瘤耐药,指导临床治疗策略的有用手段,它能观测用药前后及复发时肿瘤细胞的耐药基因mRNA表达变化,从而及时调整治疗方案和评价疾病的预后。3.4病毒感染的定量监测扩增技术的发展使得对病毒的定性或定量检测的能力随之提高,也使研究病毒载量和疾病进展的关系成为可能。Real2time PCR是主要被运用于科研和诊断领域的扩增技术,它不仅能对病毒定性,而且由于其实验的批间和批内差异小,重复性好,因此能方便、快速、灵敏、准确地定量病毒DNA或RNA的序列,更重要的是从中可以动态地研究在整个病程中潜在病

21、毒的复活或持续,从而使临床医生和病毒学家能检测临床的变化,如抗病毒治疗的效果,耐药变异的出现等。目前我们实验室通过荧光定量PCR技术来检测SI VSHI VS AI DS恒河猴模型的病毒RNA载量,在SI VSHI VS AI DS恒河猴模型研究中,最重要是确切了解病毒和疾病发展过程,因此病毒载量的有效测定非常重要。一直以来,我们只有定性PCR这一种方法。PCR方法的敏感性是很高的,但不能精确定量,只能得出“有或无”的结论,无法依据定性PCR 的结果判断出病毒的走势,不能真实反映艾滋病模型猴(S AI DS的病毒感染状态。尤其现在开发的许多抗艾滋病药物和治疗性疫苗都是针对病毒感染过了急性期,进

22、入平台期这个疾病阶段的,所以这个方法在这个阶段应用价值不大。因此,实时荧光定量的方法检测猴免疫缺陷病毒(SI VSHI V载量显得非常重要。荧光PCR技术自建立以来,发展迅速、应用广泛,表明出明显优势。近些年来,许多科研工作者基于荧光PCR的基本原理对荧光PCR技术进行不断深入的研究和改进,使荧光PCR技术得到了进一步的完善,并在此基础上开发出了许多新的荧光PCR 技术。随着荧光PCR技术的不断发展该技术将在生物学、医学基础研究以及实验动物学等广泛的领域中得到更加广泛的推广应用。参考文献1Chung HW.Reverse transcriptase PCR(RT2PCRand quantita

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