PCR-RNA转录本分子杂交用于急性淋巴细胞白血病微小残留病的检测

1、    PCR-RNA转录本分子杂交用于急性淋巴细胞 白血病微小残留病的检测        【摘要】目的为了快速、敏感地检测急性淋巴细胞白血病(急淋)微小残留病。 方法以T细胞受体链基因重排为标志基因，将确诊时标本扩增后的PCR产物转录成放射标记的RNA探针，而不同病期标本的PCR产物转录成待测RNA，待测RNA与探针杂交后经RNase A消化，之后再经聚丙烯酰胺凝胶电泳和放射自显影。 结果急淋细胞系DNA对数稀释试验表明本方法的敏感度在10-5水平。1例急淋完全缓

2、解期微小残留病也被成功地检测出来。而当探针和待测RNA并非来自同一个体时，交叉杂交的结果为阴性。 结论为临床检测急淋微小残留病提供了一种有效手段。【关键词】聚合酶链反应T细胞受体链基因重排微小残留病急性淋巴细胞白血病DETECTION OF MINIMAL RESIDUAL DISEASE IN ACUTE LYMPHOBLASTIC LEUKEMIA USING PCR-MOLECULE HYBRIDIZATION OF RNA TRANSCRIPTSLiang Xinquan*【Abstract】ObjectiveTo detect acute lymphoblastic leukemia

3、's (ALL's)minimal residual disease(MRD) rapidly and effectively.MethodsIn this assay, the gamma T-cell receptor gene rearrangements serve as marker genes. The gene rearrangements are amplified from the diagnostic specimens using a consensus V segment primer and a consensus J segment primer t

4、o which the promoter T7 RNA polymerase has been appended. The PCR product from this amplification is transcribed into a radiolabeled RNA probe. The opposite DNA strand is transcribed into test RNA from the PCR product of different staged specimens. The test RNA is hybridized with the probe, and late

5、r the digestion with RNase A, Polyacrylamide gel electrophoresis and autoradiography are in progress.ResultsAccording to the mechanism, the perfectly matched RNA duplex can prevent the digestion of RNase A, and the presence of the leukemia cells in the test specimen can be determined. Logarithmical

6、dilution experiments with DNA of a cell line from ALL have shown that this assay's sensitivity is at the 10-5 level. Minimal residual disease was successfully detected in a case of ALL during its complete remission stage. But if the probe and test RNA are not from the same individual, the result

7、s of this kind of cross hybridization are negative.ConclusionThe above results suggest that this assay can become an effective measure in the detection of ALL-MRD clinically.【Key words】Polymerase chain reactionGamma T-cell receptor gene rearrangementMinimal residual diseaseAcute lymphoblastic leukem

8、ia目前，在急性淋巴细胞白血病(ALL)微小残留病(MRD)的检测中，常以免疫球蛋白或T细胞受体基因的克隆性重排作为标志基因，我们选用T细胞受体链基因重排(TCR)作标志基因，采用PCR-RNA转录本分子杂交法检测ALL-MRD，现报道如下。1材料与方法1.1细胞系和患者标本SUP-B7细胞系细胞，来自1例CALL患者的白血病细胞，含有TCR基因重排1。例1为6岁女性ALL患儿，FAB分型为L1，免疫分型为非T-型，其DNA标本分别取自患者确诊时和完全缓解期(CR)骨髓。1.2聚合酶链反应(PCR)反应体系50l，模板DNA(苯酚抽提)0.51.0g，每种引物25pmol，引物序列为：(1)扩

9、增探针标本引物：P1为5GCTAATAC-GACTCACTATGGGAGAGACAACAAGTGTTGT-TCCAC；P2为5CGGCTACATCCACTGGTACCT。(2)扩增待测标本引物：T1为5GCTAATACGACTC-ACTATGGGAGACGGCTACATCCACTGGTACCT；T2为5GTTCCACTGCCAAAGAGTTTCTT。Taq DNA聚合酶2U，4×dNTP终浓度各100mol/L。每轮扩增为94 60秒(第1轮240秒)，60 120秒，7090秒(最后1轮360秒)，共30轮。每份PCR产物用2%琼脂糖电泳时可见一预知大小的单一条带为阳性结果。1.3

10、体外转录转录体系50l，PCR产物6l作模板，T7 RNA聚合酶50U，各自终浓度为4mmol/L的4种单核苷酸，转录放射标记的探针时用74mBq/ml(2mCi/ml)-32P-UTP代替普通的UTP，RNasin 10U。上述混合液在37水浴中孵育15分钟，再经RNase-free DNase I 1U(Life Technologies公司)消化以去除模板DNA。上述转录本经苯酚抽提、无水乙醇沉淀后重溶于80l杂交缓冲液中。1.4RNA转录本分子杂交及RNase A消化探针RNA与相应的待测RNA以19的比例在总体积40l的杂交缓冲液中杂交。杂交混合物经9510分钟后转入64水浴中孵育过

11、夜。次日加入40gml RNase A300l，4250水浴中消化30分钟；随后加入10% SDS 20l以终止消化。1.5放射自显影杂交产物经含7.6molL尿素的6%聚丙烯酰胺凝胶(PAG)电泳。电泳后的PAG经冰乙酸固定后置X光胶片在-20曝光过夜。2结果2.1实验原理如1所示，我们所用2对引物P1P2和T1T2分别互补于TCR重排基因内相差13个碱基的保守序列2，其PCR产物分别被转录成放射标记的RNA探针和未标记的RNA待测分子。在两对引物中，P1和T1分别在5端带有T7 RNA聚合酶启动子3，目的是使两份PCR产物在转录时分别以互补的两条DNA单链为模板，其结果是转录成互补的两个R

12、NA转录本。如引物P1P2和T1T2扩增的是SUP-B7细胞系TCR重排基因，则其PCR产物的分子量分别是281bp和268bp，其相应的转录本分别为263bp和250bp。如果待测标本中存在来自探针标本的特异性重排基因，那么探针和待测RNA杂交后形成的精确配对的RNA双链能抵抗RNase A的消化，电泳后未被消化的探针分子量为244bp(探针5突出的19bp单链被消化了)；如果待测标本中不含探针标本中的特异性重排基因，则杂交后的RNA双链因存在不完全配对而被RNase A消化断裂，电泳后则只能看到分子量更小的探针片段。2.2敏感度与特异性 1实验原理示意Fig 1The assay'

13、s schematic representation纯细胞系DNA制备探针用正常人DNA按对数级别稀释SUP-B7细胞系DNA。取不稀释的SUP-B7DNA制备成探针；以不稀释及各种稀释浓度的SUP-B7 DNA制备成待测RNA，杂交后的结果如2。未杂交且未经RNase A消化的探针为一预知分子量为263bp的条带4(第9道)；当杂交混合液中不加待测RNA时，探针被完全消化了(第8道)；而当探针与未稀释DNA制备的待测RNA杂交时，则可见到不被消化的探针(分子量244bp，第1道)，随后的第27道表明，这条带的强度随着待测标本按对数级别2SUP-B7细胞系对数稀释敏感度试验Marker系pBR

14、322Hae PAG电泳后银染色结果3不纯细胞系探针敏感度试验(第14道)；病例1 MRD检测(第57道)；交叉杂交结果(第811道)Fig 2Logarithmical dilution sensitivity test of SUP-B7, a cell line. Marker is the pBR 322/Hae , PAG electrophoresis, silver nitrate dyeing;Fig 3Sensitivity test of the impure cell line's probe (lane 1 to 4); Detection of case 1

15、MRD (lane 5 to 7); Result of the cross hybridization (lane 8 to 11)逐渐被稀释而降低，至10-6-2浓度的SUP-B7 DNA制备成RNA探针，分别与10-2、10-3、10-4浓度水平的待测RNA杂交，结果3个杂交产物均可检测到不被消化的探针(依次见3中的13道)。第4道为未杂交亦未经RNase A消化的10-27探针与例1确诊标本制备的待测RNA杂交，上述结果均未见到不被消化的探针(见3第811道)。2.3临床病例MRD的检测将例1确诊时标本制备成探针，分别与其确诊标本和CR期标本制备的待测RNA杂交，结果均可见不被消化的探

16、针，前者的强度比后者稍强(见3第5、6道，第7道为未杂交亦未经RNase消化的探针，中显示其分子量分别与SUP-B7相当)。3讨论文献报道，几乎所有的T系ALL和40%70%的B系ALL均有克隆性的TCR基因重排，这说明以其作为标志基因涵盖面较大。我们对SUP-B7细胞系DNA的对数稀释试验表明本方法的敏感度在10-5水平，而Southern杂交的敏感度是无法与其相比的，而且即使用10-2浓度DNA制备的探针仍可检测10-4水平的待测RNA，说明临床即使使用不纯的肿瘤细胞标本制备探针，其敏感度亦不存在大的影响。存在于ALL患者的克隆性Ig或TCR重排基因，其结合区在重排时由于随意插入和丢失的单

17、核苷酸及其数目不同而使每一病例具有个例特异性。为了保证检测ALL-MRD方法的特异性，可靠的方法是利用重排基因结合区序列的这一特性，(1)对确诊标本进行PCR扩增；(2)对扩增产物进行测序；(3)根据测序结果合成一条与结合区序列互补的寡核苷酸引物或探针；(4)对待测标本进行PCR扩增或分子杂交57。这些措施确实较好地保证了方法的特异性，但问题是对每一病例进行测序和寡核苷酸合成既费时费力又相当昂贵。因此有人对确诊标本的IgH CDR 基因的PCR产物分离出单链后标记成探针，与不同病期的PCR产物杂交，杂交产物再经S1核酸酶消化而获得最后结果8，这在方法上就大大简化了。我们这里通过两对引物上T7启

18、动子的作用，使探针与待测RNA互为互补，根据精确配对的RNA双链能抵抗RNase A消化的原理，可以通过杂交后的消化结果确定待测标本中特异性重排基因的存在与否。这样，在保证了特异性的基础上使本方法更为简便，更利于临床应用。病例与正常人及细胞系之间的交叉杂交结果阴性及临床CR期标本MRD的成功检测正好证明了这一点。志谢美国Emory大学医学院儿科血液病所周木想教授提供SUP-B7细胞系DNA参考文献1Smith SD, Shatsky M, Cohen PS, et al. Monoclonal antibody and enzymatic profiles of human malignant

19、 T-lymphoid cells and derived cell lines. Cancer Res, 1984,44(12)5657-5560.2Yokota S, Hansen-Hagge TE, Ludwig W, et al. Use of PCR to monitor minimal residual disease in acute lymphoblastic leukemia patients. Blood, 1991,77(2)331-339.3Dunn JJ, Studier FW. Complete nucleotide sequence of bacteriophag

20、e T7 DNA and the locations of T7 genetic elements. J Mol Biol, 1983,166(4)477-535.4Tycko B, Palmer JD, Link MP, et al. PCR amplification of rearranged antigen receptor genes using junction-specific oligonucleotides: Possible application for detection of minimal residual disease in acute lymphoblastic leukemia. Cancer Cells, 1989,7(1)47-55.5D'Auriol L, Macintyre E, Galibert F, et al. In vitro amplification of T cell gene rearrangements: A new tool for the assessment of minimal residual disease in acute lymphob