中医药中基因科技的运用

1、中医药中基因科技的运用 基因芯片又称为 DNA 微探针阵列( Microarray) ，是生物芯片( biochip) 的一种，是指在尼龙膜、玻璃硅片或瓷片等固相载体上的一微小区域内( 1cm2) ，将成千上万条高密度 DNA( 点与点间距一般小于 500m)探针有序地排列，形成一种 DNA 微矩阵，将样品DNA / RNA 通过 PCR / RT PCR 扩增、体外转录等技术掺入标记分子后，与标记了的待测样品进行杂交( hybriding) ，通过同位素法、化学发光法、化学荧光法或酶标法显示。以芯片扫描仪对芯片进行扫描，检测每一点杂交信号的有无及强弱，由相应统计软件进行统计分析1。它具有高通

2、量、大规模、高度平行性、快速高效、高灵敏度、高度自动化等优点，是伴随人类基因组计划的实施而发展起来的前沿生物技术，已经快速应用到包括表达谱分析、新基因发现、基因突变及多态性基因表达谱分析、基因测序、microR NA、疾病诊断分类和预测、药靶发现、药物筛选、毒理、药理和药效等方面，为人类研究生命的起源、遗传、发育与进化; 为人类疾病的预防、诊断、治疗开辟了全新的途径; 为药物的设计开发、快速筛选、药物基因组学研究提供了优良的技术支撑平台。目前基因芯片技术已经广泛应用在中医药研究中，主要表现在证候、病机、藏象、经络、针灸研究以及中药的研制开发等方面。1 中医证的研究中医“证”是中医药临床治疗的核

3、心，阐明中医“证”的本质是实现中医药现代化必须解决的问题。但“证”的本质研究一直难以有重大进展，早期虽在器官、组织、细胞层次上有一定进展，但难以突破。后来即使利用分子生物学方法来研究中医药，往往从单基因的角度来探讨中医药在基因水平的变化，而很少从多基因的角度来研究。利用基因芯片技术的高通量和平行检测的优点，从基因层面阐述和发现中医“证”的本质与内涵，通过研究“证”和基因多态性之间的内在联系来探求“证”的相关基因表达谱; 而通过基因表达谱和表达产物的差异性分析，则可以揭示证候发生和发展在分子水平的调控规律。通过基因芯片的方法筛选寒证服用热药有疗效者的基因表达谱，探索寒证所涉及的相关基因类别。结果

4、初步筛选出了差异表达基因 9 条，涉及到与能量代谢、糖代谢、脂类代谢、蛋白质代谢、核酸代谢、免疫和内分泌等 7 类与寒证有关的基因。通过基因表达谱的相关性研究，揭示虚寒证基因组的规律2。通过基因芯片技术探讨脾气虚证免疫相关基因组学机制，选择脾气虚证慢性胃炎和溃疡性结肠炎病例及正常人各 3 例，分别采集其外周血，提取白细胞 RNA 行基因芯片检测，结果慢性胃炎脾气虚证和溃疡性结肠炎脾气虚证异常表达的免疫相关基因分别为 68 条和 57 条，两者相同的差异表达基因为 7条，主要是与免疫相关的基因。提示脾气虚证发生有其免疫相关基因组学基础，是细胞免疫、体液免疫以及非特异性免疫功能等方面发生功能紊乱3

5、。通过对糖尿病家系中与肾虚( 阴阳两虚) 血瘀相关联的基因表达谱的研究发现: 虚证与基因下调有密切联系，对分类基因的分析发现: 肾阴阳两虚与广泛的功能基因相关，血瘀证与血流血压的相关基因有关4。中医存在同病异治，和异病同治，同一疾病证表现不同，所采用的治法也不同，不同的病证相同，所采用的治法也相同。辨证论治的，利用基因芯片检测不同证的基因表达谱的改变，根据基因表达谱的不同给予不同的治疗，从而实现中医证的临床诊断的现代化。运用大规模、高通量的基因表达检测技术，对大量的同一证型疾病状态下的各类组织和细胞的 mRNA 进行定量分析，编制疾病证型基因表达谱，经过生物信息学和统计学的比较分析，就可以建立

6、疾病证型特定的基因表达谱数据库。2 中医基础理论的研究2. 1 整体观的研究 中医认为人体是个有机的整体，构成人体的各个部分之间，在结构上是不可分割的，在功能上是相互协调、相互为用的，在病理上是相互影响的，人体与自然环境有着密切的关系。基因组学是从基因组整体水平上对基因的活动规律进行阐述，它是从整个基因组的层次来阐明所有基因在染色体上的位置、结构、基因产物的功能以及基因与基因之间的关系，具有鲜明的“整体性”。基因组本身就是“整体”，任何一种表型特别是涉及复杂表型的疾病状态，在遗传背景上涉及“基因组型”和基因组表达谱的改变，这种改变本身就涉及众多基因或蛋白质的变化。因此，基因组学是从整体上研究各

7、个基因之间的结构与功能的关系。近来又有学者提出“环境基因组学”这一概念，揭示了环境因素( 如生活方式、饮食、年龄、自然环境与社会环境) 与人体基因的相互作用与影响。这与中医学的整体观念具有惊人的相似之处。2. 2 阴阳学说的研究 阴阳学说认为，机体是阴阳二气相互对立的统一体。阴阳相对协调则表示人体机能处于正常状态; 疾病的发生及其病理过程，则是因某种原因导致机体的阴阳平衡失调。正如素问生气通天论所论: “阴平阳秘，精神乃治; 阴阳离决，精气乃绝”。基因之间也存在着动态的平衡，这种平衡一旦失调，则人体就会出现病理状态。基因按其功能可分为结构基因与调控基因，从基因作用结果来看，调控基因影响结构基因

8、表达，它没有对应的蛋白质生成，为机体活动，属阳; 结构基因的表达一方面合成特定蛋白质，同时又为调控基因的存在提供物质基础，其为物质，属阴。调控基因与结构基因保持着对立统一的协调关系，使基因得以在复制、转录、翻译等蛋白质合成过程中发挥正常作用。基因组的“内含子”与“外显子”相当于一对阴阳，“内含子”中又有促进基因表达的“增强子”和抑制基因表达的“抑制子”，它们又相当于一对阴阳。可见，基因组中阴阳无处不在。2. 3 五行学说的研究 五行学说用五行的生、客、乘、侮解来阐释人体的生理与病理。根据阴阳五行学说，事物在发展过程中有“亢则害，承则制，制则生化”的规律。人体内各种基因组之间也存在着这样的规律，

9、基因组的正常表达必须在承制的条件下才能进行，如果其某一环节失去制约与平衡，则会出现“亢则害”的情况，基因非正常表达则会出现病理状态，疾病的发生常常是其相关基因的多种功能和这些功能的相互作用失衡而导致。搞清同组基因不同功能与不同基因功能之间的生克制化关系，对于中医理论的发展具有重要的意义。2. 4 藏象学说的研究 藏象学说，即是通过对人体生理、病理现象的观察，研究人体各脏腑的生理功能、病理变化及相互关系的学说。随着分子生物学的发展，基因芯片技术的不断成熟和广泛应用，已经有诸多藏象理论的研究中引入了基因芯片技术。针对从肾虚及补肾机制的研究，有学者对 地中海贫血的 珠蛋白基因转录进行研究，证实益髓生

10、血颗粒通过下调铁蛋白基因表达，促进体内铁的吸收和代谢，有效降低了体内铁负荷，减少体内铁的蓄积，明显缓解临床症状5。3 病因病机研究病因是引起人体疾病的原因，导致疾病发生的原因多种多样，主要有六淫和七情等。病机是疾病发生、发展与变化的机制，疾病的发生、发展与变化，与患病机体的体质强弱和治病邪气性质密切相关，疾病的病机总体离不开邪正盛衰、阴阳失调、气血失常和津液代谢失常等。疾病有复杂的病因病机，而是由多基因、多因素、遗传和环境共同作用的结果。邪盛正衰是疾病发病的关键，邪盛可能表现为人体某些基因的过度表达，功能亢盛以及某些基因发生了异常改变; 正衰表现为人体某些基因表达受到抑制，通过了解基因在疾病发

11、生、发展与变化的表达情况，就可能明确引起疾病的发生的病因，以及导致疾病变化的病机。通过建立脾虚胃癌转移鼠的病证结合动物模型，采用基因表达谱芯片技术作本模型的基因差异表达的检测。结果证明了脾虚在胃癌的发生、发展过程中有着重要作用，这种作用可能是通过影响一系列的胃癌相关基因的异常表达完成的6。肾阳虚证形成的一大分子机制是动态调节细胞凋亡，使与细胞凋亡的相关基因表达异常7。4 治则治法研究治则是在整体观和辨证论治的指导下制定的，对临床治疗立法、处方、用药，具有普遍指导意义的总则。它是用以指导治疗方法的，治法是治则的具体化。通过对治疗前后，机体差异基因的表达的研究，可从分子水平揭示治则治法的科学内涵。

12、动脉粥样硬化的ET 1mRNA 和 iNOSmRNA 表达较多，而 eNOSmRNA表达较少，消瘀片可通过降低兔动脉粥样硬化模型血管壁中的 ET 而抑制平滑肌细胞的增生，通过增加血管壁中的 NO 诱导细胞凋亡及加强对凋亡细胞的调节8。ras 癌基因在心肌肥厚形成、发展过程中起着一定的作用，中医活血祛痰治法可逆转心肌肥厚，其治疗机理可能是抑制了心肌 ras 原癌基因的高表达9。上海中医药大学与美国科罗拉多大学医学院合作，采用Affymetrix Rat 230A GeneChip( 每张芯片含有 15710 个基因) ，检测了不同中医治法治疗二乙基亚硝胺( DEN) 诱导大鼠肝癌后大鼠肝组织(

13、含肝癌组织) 基因表达的差异。研究发现，模型组与正常组相比，表达增高的基因达 2796 个; 表达下降的基因为 276 个。经中药全方治疗后，有 582 个基因表达较治疗前出现下调，表达小于其余中、西药对照组的基因计 342; 清热解毒法组基因下调 291 个; 行气活血法组基因下调377 个; 健脾益气法组基因下调 892 个，不同的治法，基因均有不同程度的下调10 13。5 辨证分型与诊断的研究所有疾病均存在基因表达的变化，不论是器质性疾病还是功能性疾病，都可以从基因上去探究病因，寻找防治方法。有人估计约有 6000 种以上的人类疾患与各种人类基因的变化相关联。辨证论治是中医的精华，中医在

14、很多疾病的治疗中表现了确切的疗效。但中医在辨证论治过程中存在着证候概念命名和证候辨证标准的不统一，缺乏客观的实验室量化指标，更难以从微观量化指标来评价等问题，阻碍了中医理论的发展及中医药现代化和国际化的进程。随着人类基因组计划的深入，尤其是功能基因组学研究技术的不断发展，从基因组微观分子水平研究中医基础理论辨证分型的时机已经成熟。运用大规模、高通量的基因表达检测技术，对大量的同一证型疾病状态下的各类组织和细胞的 mRNA 进行定量分析，编制疾病证型基因表达谱，经过生物信息学和统计学的比较分析，就可以建立疾病证型特定的基因表达谱数据库。设想证型基因表达谱数据库可由与脏腑、阴阳、气血、寒热、虚实相

15、关的特定基因表达谱数据库组成，编制患者的基因表达谱，与数据库中的已建立的证型特异基因表达谱进行生物信息学比较分析，就可以做出辨证分型诊断，使诊疗过程“程序化”，这项研究工作可以从一个新的视角系统，全面深化人们对中医气血、阴阳、寒热、虚实等生理病理规律的认识14 16。6 针灸学的研究6. 1 经络的研究 根据经络理论，对不同的穴位采用不同的刺激方法、频率和强度，可导致有关基因转录的差异，利用基因芯片能观察这种差异以及时段的变化和因果关系，进一步认识针灸经络现象。经络“内属于脏腑，外络于肢节”，经络的实质可能主要表现为经络脏腑相关研究，即经络与脏腑间相关的相对特异性。经脉与脏腑具有相关性，针灸的

16、作用机制涉及全身各个系统，经络与相应的内脏间存在的相对特异性联系。通过基因芯片测量不同组织基因表达的差异，判断基因表达是否具有特异性，来明确经络现象的科学内涵。针刺足三阳经以胃经组对家兔胃黏膜损伤保护作用最强，其机制可能与调整有关脑肠肽及生长抑素受体基因表达有关17。6. 2 针刺机理的研究 目前文献对应用基因芯片技术针刺治疗中风、抗衰老、减肥等机理研究较多。中风。研究发现，电针治疗大鼠缺血性中风的早期作用机制可能通过了抑制 c fos 蛋白的表达进而调控其后发的凋亡相关基因18。针刺预处理和脑缺血预处理均可能通过上调 c fosmRNA 表达而减轻严重缺血后细胞凋亡19。醒脑开窍针刺法可增加

17、大鼠梗塞区皮质、纹状体、海马 HSP70 基因表达20。陈泽斌等21采用基因芯片技术发现: 一些针刺诱导的基因表达产物在针刺预处理抗脑缺血再灌注损伤过程中发挥了重要作用。电针抑制大鼠神经元凋亡的发生机制可能通过升高 bcl 2 表达途径，可能不是通过抑制 P53 基因蛋白高表达实现的针刺可阻断实验性脑出血大鼠的ET 基因表达22。抗衰老。研究发现，针刺对衰老机体紊乱的分子网络能发挥整体调节作用23。针刺可改善 SAMP10 胰岛素样生长因子表达24。针刺后SAMP10 小鼠的 HSP84、HSP86 在全脑、皮质、海马中的表达上调并趋于正常25。针刺减肥。针刺对肥胖机体中枢和外周瘦素和 INS

18、 水平的良性调整作用以及促进下丘脑 OB R 基因表达可能是针刺减肥的细胞分子重要机制26。心肌缺血。电针大鼠“内关”改善急性心肌缺血的机制与下调心肌组织 c fosmRNA 的表达有关27。绝经后骨质疏松。针灸治疗绝经后骨质疏松症是通过调控 TNFmRNA 表达，从而控制TNF 蛋白合成来实现的28。骨关节炎，采用基因芯片技术研究发现: 经温针治疗显效肾阳虚证骨关节炎患者治疗前后的基因芯片比较结果显示: NM000265、NM001838 基因普通上调，NM_001784 基因普遮下调，其他基因表达无规律性变化29。针灸是作用于人的整体，涉及到神经、内分泌、免疫等多个调节系统的相互作用，而且

19、不同针刺条件也可能会产生不同疗效。通过引入基因芯片，可以高通量地检测细胞内基因表达的时空特征，有助于了解针灸促进基因表达的特点; 进而再利用蛋白组学、生物信息学分析技术，有望揭示针灸作用机制; 通过检测人体得气前后基因表达差异，及其在什么脏器或组织的表达，有利用了解得气的实质。也有利于指导针灸得气;通过检测行补法和泻法时人体基因表达的差异来研究补泻的使用条件。通过研究不同时辰相应部位基因表达的差异来研究按时开穴法的疗效。通过研究针刺配伍穴位相应基因的差异，优选最佳的穴位处方。针刺手法的量化标准化是针灸目前要迫切解决的问题，针刺手法是针刺疗效的关键，时间、方向与频率是针刺手法的重要因素，通过基因

20、芯片技术，研究不同手法要素下，基因的差异表达，选择最佳的手法要素，明确针刺的量学规律，进而明确针刺手法的生物学机制。6. 3 灸法的研究 现代研究证明灸法可调节内分泌功能，提高体内必需的微量元素，提高血中超氧化物歧化酶的含量，降低血中过氧化脂质含量，提高免疫功能，改美血液高、黏、凝聚状态。但在，灸法作用机理方面，仍缺乏基因组表达水平方面的量化指标。基因芯片能一次性地同时检测成千上万个基因的表达，用于分析灸法对基因表达的综合影响，既可得到大量的微观信息，又可综合性地观察宏观的作用趋势，可成为灸法现代化研究最佳的切入点。调节炎性反应基因是灸命门穴位延缓衰老的机制之一，灸命门穴通过调节炎性基因的表达

21、，达到延缓衰老的目的30。7 中药学的研究目前中医药现代化的关键问题是缺乏可以量化的现代生物学指标，基因芯片系统、全面、综合研究思维用于中药学研究，可以大规模地用于药物筛选，通用性强，适用范围广，能够从基因水平阐释药物作用的机理。7. 1 药物作用靶标及机制的研究 中药具有多效性、量效关系复杂性、相对不稳定性，和某些药物具有双向调节作用的特点，在作用方式上具有多成分、多环节、多靶点等复杂性，以往的药物研究方法很难从整体深入到细胞水平。如何分离鉴定药物的有效成分从大量的靶分子中发现可靠的药靶是中医药产业化的最大障碍。现代药理研究证明药物作用的却具有“靶基因”，目前已知可以作用药物的靶基因约有 5

22、00 个，并且在人类基因组可用于疾病治疗的药物靶点约有 3000 10000 个，通过靶基因，可以迅速的确定几百个潜在的新型药物靶体，对成千上万的基因在不同细胞部位的表达进行追踪，为中药的机制研究提供科学证据。杨柳等31利用基因芯片技术分析杞菊地黄汤防治 N 甲基 N 亚硝酸脲( MNU) 诱导大鼠视网膜变性的视网膜基因表达谱变化，结果表明，模型组/正常组和模型组/药物组中分别有 75 个和 118 个差异表达基因，这些基因多与信号转导、发育、免疫和防御、凋亡等生物过 程 有 关，主 要 涉 及 到 丝 裂 原 活 化 蛋 白 激 酶( MAPK) 、Toll 样受体和凋亡信号通路。7. 2

23、有效成分的筛选 中药起效的关键是有效成分，传统有效成分的筛选耗时长、工作量大、经费高，投入量大，但产出少，利用高通量基因芯片筛选方法，可以避免大量动物实验，缩短药物筛选时间，筛选出中药有效成分和部位，能够更准确的了解药物组分的配伍作用特点。国外学者对黄连的抗肿瘤增殖活性的有效部位进行了筛选，使用了含有 12600 个基因的 DNAmi-croarray 而检验了黄连及 8 个组分的抗增殖效应，发现27 个基因和黄连的 ID50 相关，其中黄连素是主要的抗增殖活性成分32。7. 3 药物毒理与中药安全性的研究 中药的安全性一直是近几年来国内外关注的热点。如何准确、快速、高效地评价中药复方及其组成

24、药物是否有毒? 如何确定有毒中药、中药的有毒成分、中药的有毒部位? 是中医药走向国际的重要问题，通过基因表达谱分析研究某种中药或其提取物作用于细胞后基因表达 mRNA的变化，如发现一些重要的功能基因表达有明显改变，则提示此物质在研究剂量下可能有一定的毒性。传统毒理学研究，尤其是慢性毒性和不良反应，耗时长，需要的人力和物力多，而且还有可能遗漏某些可能存在的潜在毒性和不良反应。而在基因组水平进行分析，观察中药对人体一些看家基因( house keeping gene)成分是否具有影响，如细胞骨架基因、组蛋白基因等，便能彻底了解该中药的可能毒性和不良反应。Nuway-sir 等33研制了包括涉及细胞凋亡、DNA 复制和修复、氧化应激或氧化还原内稳态、过氧化物酶体增殖反应、二恶英或多环芳烃反应、雌激素反应、看家基因、癌基因和抑癌基因、细胞周期控制、转录因子、激酶、磷酸酶、热休克蛋白、受体、细胞