产气荚膜梭菌实时荧光PCR方法的建立

1、 石玉玲等:产气荚膜梭菌实时荧光PCR方法的建立391图l产气荚膜梭菌荧光定PER检测敏感性的扩增结果2.4荧光定量PCR检测产气荚膜梭茵的特异性对创伤弧菌、弗劳地枸橼酸杆菌、产吲哚黄杆菌、ATCC25923金黄色葡萄球菌、ATCC27853铜绿假单胞菌、ATCC25922大肠埃希菌、ATCC35656多食鞘氨醇杆菌、ATCC43047阴沟肠杆菌、ATCCl2453奇异变形杆菌、ATCC35157肺炎克雷伯菌、ATCCl4028伤寒沙门菌、ATCC51331嗜麦芽窄食单胞菌分别提取核酸,用本研究建立的方法进行检测。除产气荚膜梭菌出现很好的阳性结果外,其他细菌检测结果均呈阴性。说明我们建立的荧光

2、定量PER检测方法对产气荚膜梭菌有较好的特异性,与其他细菌无交叉反应。2.5临床样本中产气荚膜梭茵的检测病例A:患者,男性,26岁。于2010-0204因汽车压伤致左踝、足裂伤流血、畸形2h入本院。左踝和足内侧的皮肤、骨、足拇长伸肌腱、足背动脉缺如,骨、肌肉外露,创面脏污。各足趾末梢血运较差,第1趾感觉麻木、发白。足底皮肤完全剥脱。X线片示左踝关节骨折并脱位,左足多发骨折并部分骨缺损,软组织高度肿胀,取分泌物进行检测。病例B:患者,男性,81岁,于20100327因“右下肢髂窝脓肿,手术后形成漏口”入南方医科大学附属医院,取穿刺液进行检测。病例C:患者,男性,44岁,有糖尿病病史,于2009-

3、09-16因“右下肢进展性红肿、溃疡、流脓、坏死伴疼痛1月”人本院,取分泌物进行检测。采用本方法,能准确检测到临床样本中产气荚膜梭菌的存在,阴性对照无荧光存在,整个检测过程34h完成,大大缩短了检测时间,为产气荚膜梭菌的临床诊断提供了一种快速可靠的诊断方法。3讨论产气荚膜梭菌为革兰阳性粗大梭菌,大小为(3-4×(11.5lxm,单独或成双排列,有时也可成短链排列;芽胞呈卵圆形,芽胞宽度不比菌体大,位于中央或末次端;在脓汁、坏死组织或感染动物脏器的涂片上,可见有明显的荚膜,无鞭毛,不能运动。根据细菌产生外毒素的种类差别,可将产气荚膜梭菌分成a,b、e、d、e等5型。对人致病的主要是a型

4、,引起气性坏疽和食物中毒,c型则引起坏死性肠炎。产气荚膜梭菌是气性坏疽的主要病原菌。气性坏疽是战时多见的一种严重的创伤感染,以局部水肿、产气、肌肉坏死及全身中毒为特征,病亡率高达 圈2佐床标本中产气荚膜梭菌DNA的扩增曲线LETTE I H.,l圈3病例A、B厌氧血平板培养结果40%一100%。在战争状态下,由于疫原通常是多样性的和未知的,一旦发生气性坏疽,样品的检测量大、生物安全性要求高,重要的是危害性评估要求定量准确。然而,目前国内外均未见对产气夹膜梭菌引起的人体气性坏疽检测方法的报道,因此有必要建立一种快速测定产气荚膜梭菌的方法,以满足日常和战时需要。近年来的文献资料显示,实时荧光定量P

5、CR技术具有准确性高、重现性好等特点,已广泛用于基因表达病原体检测等诸多研究领域【卅。实时荧光定量PCR技术在普通PCR的基础上又高了一个新的水平,无论敏感性、特异性与速度都具有优势。但它对引物和探针也提出了更高的要求151,因为引物与探针的设计直接影响方法的特异性和灵敏度。为了保证方法的特异性,我们选取产气荚膜梭菌高度保守的16S rRNA基因,相对于其他物种具有高度特异性。经过大量比对、筛选,最终确定一对引物,并在该引物的扩增区内设计一条特异性荧光探针。为了保证方法的灵敏度和扩增效率,获得检测最低Ct 值和最高荧光强度值(ARn,同时对所建立的实时荧光PCR方法进行了引物、探针浓度优化,确

6、定了反应体系和反应参数。经过对创伤弧菌等12种相关细菌菌株的检测,发现不仅特异性高,而且比传统培养法更敏感、快速,也更简便。用本方法从核酸提取至完成检测,最快能在3h内完成,对纯菌检测的灵敏度低于10CFU/反应体系,一次检测量可以达到96或384个样本,而且该方法实行完全闭管式操作,从根本上杜绝了常规PCR扩增产物污染和假阳性的问题。对临床标本的检测结果显示,病例A、B患者产气荚膜梭菌荧光定量PCR检测阳性,3d后细菌厌氧培养分离到产气荚膜梭菌,说明该方法可早期、快速诊断产气荚膜梭菌感染,为临床治疗提供有力依据。病例C患者伤口分泌物涂片可见大量革兰阳性菌,从临床症状分析,多数医生考虑气性坏疽,而荧光定量PCR方法检测产气荚膜梭菌阴性,细菌厌氧培养分离到多毛拟杆菌、消化链球菌,未见产气荚膜梭菌。提示多种细菌感染特别是混合厌氧菌感染时可同样表现出皮下肿胀、腥臭味和捻发音,而显微镜下难以鉴别。因而在临床怀疑气性坏疽时,应行荧光定量PCR快速检测产气荚膜梭菌,避免因误诊导致患者截肢。我们针对产气荚膜梭菌,成功