人参皂苷Rh2含量测定方法及药理作用研究现状

1、人参皂苷人参皂苷 Rh2Rh2 含量测定方法及药理作用研究现状含量测定方法及药理作用研究现状作者：李学哲，朴惠顺 作者单位：1.延边大学附属医院 肿瘤内科;2.延边大学药学院:吉林 延吉 133000【关键词】【关键词】 人参皂甙类人参皂甙类; ;抗肿瘤剂抗肿瘤剂( (中药中药););黑色素瘤黑色素瘤; ;食管癌食管癌; ;前列腺肿瘤前列腺肿瘤人参是五加科人参属植物，是传统的名贵药材.近年来，众多学者报道了人参单体的药理作用，特别是抗肿瘤作用，而研究发现人参中的抗肿瘤有效成分主要为人参多糖和人参皂苷.随着对人参研究的深入，日本学者首次从红参(人参经蒸制、烘干后得到的制成品)中发现了人参皂苷 R

2、h2.这种皂苷是次生苷，是加入过程中由某些二醇组皂苷受热降解后生成的.金凤燮等1报道了酶转化法生产 Rh2 等人参稀有皂苷，提取效果较传统方法提高了 500700 倍，实现了工业化生产，为 Rh2 的实际应用提供了可行性.本文对人参皂苷 Rh2 含量的测定方法及药理作用进行了综述.1 Rh2 含量测定方法蒋磊等2报道，采用 HPLC 法测定 Rh2 准确含量，其测定条件中流动相为甲醇乙腈水为 881，流动速度为 1mL/min，紫外检测波长为 203nm，色谱柱为 Thermo Hypersil ODS2 (250.0mm4.5mm，5.0m)，柱温为室温，回收率高于 99.74%，RSD 小

3、于 1.83%，达到了药典规定.在该色谱条件下，人参皂苷 Rh2 的保留时间均为 810min,并确定了人参皂苷 Rh2 的 R 型和 S 型含量的高效液相色谱条件为 Thermo Hypersil ODS2( 250.0mm4.5mm， 5.0m)色谱柱，流动相为乙腈水为 11，柱温为室温，流动速度为 1mL/ min，进样量为10L，检测波长为 203nm，理论塔板数按人参皂苷 Rh2 峰计算应不低于 3700，分离度应大于 1.5，得人参皂苷 Rh2 中 R 型与 S 型之比为 64,在该色谱条件下，人参皂甙 Rh2 的 R 型保留时间均为 17min，S 型保留时间均为 16min，R

4、 型在 S 型之后出峰.冯林等3报道,采用反相高效液相色谱法测定人参 Rh2 的含量，测定条件中色谱柱为 ODSC18(250.0mm4.6mm，5.m)，流动相为乙腈水(6040)，流动速度为 1 .0mL/min，检测波长为 203nm，柱温为 30，结果表明人参皂苷 Rh2 质量浓度在 80240mg/L 范围内时进样量与峰面积呈良好的线性关系，r= 0 .9992，平均回收率为 99.75 % (n=6).顾轶等4报道，采用 LCMS 法测定 Beagle 犬血浆中人参皂苷 2 0( R)Rh2 的含量，检测条件色谱柱为 Cosmosil ODS 柱(150.0mm2.0mm i.d.

5、，5m，Nacalai Tesque，日本)，外加 1 个 C18 柱 ( Security Guard，Phe nomenex，美国)，柱温为40,流动相为乙腈及 500mol/L 氯化铵水溶液，流动速度为 0.2mL/min，梯度为乙腈 40mL/L(0min)，乙腈 60mL/L(0.03min)，乙腈 80mL/L(5.00min)，乙腈 95mL/L(5.03min)，乙腈 99mL/L(7.00min),乙腈 40mL/L(7.50min),PumpStop(9.50min).质谱检测条件中离子化方式为电喷雾(ESI),检测模式为选择性离子检测(SIM),检测离子为负离子，20(R

6、)Rh2 的 m/z 为 657.35，洋地黄毒苷 m/z 为 799.55,雾化气流动速度为 1.5L/min,反吹气压力为 1MPa,曲形脱溶剂装置温度为 250，电压为-5V,加热块温度为 200,离子源温度为 250，电压为-4.5kV,四级杆流电压为 0V，交流电压为 150V,检测电压为 1.6kV.取具塞离心管数只，各加入 Beagle 犬空白血浆 1mL，精密加入不同质量浓度的 20(R)Rh2 标准品溶液 10L，分别制备成含 20(R)Rh2 质量浓度为0.5,1.0,5.0,10.0,50.0,100.0,200.0g/L 的溶液，按上述血浆样品处理方法进行操作测定.样品

7、峰面积与内标峰面积的比值(Y)及对血药质量浓度( c )作线性回归，得标准曲线回归方程( n=6 ) 为 Y=0.0244c+0.0088 (r=0.9998 ).按上述方法测得 20( R)Rh2 在 Beagle 犬血浆中最低定量限为 0.5g/L(信号噪声比大于 10)，相对标准偏差 (RSD)为 17.7 %(n=6)，符合 FDA 对生物样本LLOQ 的要求.方亮等5报道，采用大孔吸附树脂法测定梅花参芪精中人参皂苷含量，此法回收率为 94.58%，RSD 为 1.54%.2 药理作用2.1 抗肿瘤作用 人参皂苷的抗肿瘤作用已备受关注，特别是 Rh2 对多种癌细胞的直接杀伤作用.已发现

8、的作用机制有调节肿瘤细胞信号通路系统,影响细胞端粒酶的活性,阻断肿瘤细胞重要成分的合成与代谢,逆转肿瘤细胞的异常分化及耐药性,增强机体免疫力，提高抗肿瘤能力 对黑色素 B16 细胞具有明显的分化诱导作用 体外实验证明,10mg/L人参皂甙 Rh2 可明显抑制黑色素 B16 细胞的生长，并呈现质量浓度依赖性,IC50 为 4.1mg/L;对 B16 细胞有较强的分化诱导作用，表现为黑色素生成能力明显增强,形态向上皮样细胞分化,黑色素颗粒增多，生长变缓慢.细胞动力学研究结果表明，Rh2 可使黑色素 B16 细胞阻断在 G1 期,亦提示 Rh2 对 B16 细胞具有分化诱导作用7.2.

9、1.2 C6 胶质瘤细胞的抑制增殖和诱导凋亡作用 2，4，8mol/L 人参皂苷 Rh2 对 C6 胶质瘤细胞均有抑制增殖作用，且呈现出明显的量效关系;4mol/L 人参皂苷 Rh2 作用 72h 后，对 C6 胶质瘤细胞诱导凋亡作用最为明显;人参皂苷 Rh2 作用后，处于 G0/G1 期细胞百分率明显下降，而处于 S 期细胞百分率则显著增高 对食管癌 Eca109 细胞周期的影响 研究结果表明，人参皂苷 Rh2对 Eca109 细胞的生长具有抑制作用，并呈剂量及时间依赖性.人参皂苷 Rh2可将人食管癌 Eca109 细胞阻滞于 G0/G1 期，诱导肿瘤细胞分化，并通过影响细胞周

10、期调控因子 cyclinE，CDK2，p21WAF1 基因的表达来抑制食管癌细胞的增殖 对前列腺癌细胞株 PC3M 移行周期的影响 可使 PC3M 细胞增殖周期阻滞于 G1 期，延缓肿瘤细胞增殖速度 对人喉癌细胞株 Hep2 抗增殖作用的影响 人参单体皂苷 Rh2 可明显抑制 Hep2 细胞的增殖，并呈剂量及时间依赖性.用 30mg/L 人参单体皂苷Rh2 处理细胞 24h 后,G 期细胞由 60.09 %显著增加至 68.86 %，S 期细胞由18.89%明显减少至 l2.30%，G2/M 期细胞及凋亡细胞无明显变化，细胞阻滞于G1 期11.提示人参单体皂苷 R

11、h2 对人喉癌细胞株 Hep2 具有明显的抑制增殖作用，使细胞阻滞于 G1 期.2.1.6 对人类乳腺癌细胞 MCF7 增殖的抑制作用 人参皂苷 Rh2 可显著抑制 MCF7 细胞的生长，并呈剂量依赖关系，使细胞停留在 G1 期12.经 Rh2 处理细胞，其周期蛋白 D3 水平下降，而抑制 Cdk2 活性的 p21WAF1/CIP1 水平上升.Rh2 可显著降低磷酸化 pRb 的水平和转录因子 E2F1 的水平.2.1.7 对裸鼠体内人卵巢癌细胞肿瘤的生长抑制作用 在体外只需 1060mol/L 的 Rh2 即可抑制多种人卵巢癌细胞的增殖，且 IC50 剂量可诱导细胞凋亡13.Rh2 经口服给

12、药较腹腔给药效果佳,经口服给药除具有增加 NK 细胞活性的功效外，亦可诱导细胞凋亡.2.1.8 对 Bel7404 细胞及人肝癌 SMMC7721 细胞的作用 流式细胞术证实人参皂苷 Rh2 对体外培养的 Bel7404 细胞具有诱导凋亡的作用，细胞凋亡率(AR)随人参皂苷 Rh2 质量浓度的增高和作用时间的延长而升高1415，当人参皂苷 Rh2 质量浓度由 12.5mg/L 增高至 50.0mg/L 时，AR 则由 16.2%升高至27.5%，但人参皂苷 Rh2 质量浓度由 50.0mg/L 增高至 100.0mg/L 时，AR 却未见相应升高.人参皂苷 Rh2 以时间依赖性和浓度依赖性抑制

13、人肝癌 SMMC7721 细胞的增殖，10mg/L 人参皂苷 Rh2 作用 6d 后,抑制率达 50%,而 20mg/L 人参皂苷Rh2 作用 4d 后抑制率近 50%.10,20mg/L 人参皂苷 Rh2 作用于 SMMC7721 细胞后，AFP 合成量明显下降，分泌量亦从 6.600.30 显著下降到2.350.06,GT 及耐热型 ALP 活性显著降低,而不耐热型 ALP 活性及 Alb 分泌量则显著升高.2.1.9 对白血病 HL60 细胞凋亡的诱导作用 MTT 结果显示，用 060mol/L 人参皂苷 Rh2 分别处理 HL60 细胞 24,48,72h 后发现,HL60 细胞的增殖

14、明显受到抑制,且呈现浓度依赖性16.人参皂苷 Rh2 作用于 HL60 细胞48h 后,IC50 为 25mol/L.2.2 抑制肿瘤转移的作用 通过人参皂甙 Rh2 对癌细胞转移影响的实验发现，人参皂甙 Rh2 对小鼠 B16BL6 黑色素瘤细胞转移株自发性肺部转移具有显著的抑制作用，25,52mg/kg Rh2 作用后小鼠的肺转移抑制率与对照组相比较有显著性差异，8.3，16.6mg/kg Rh2 预先给药后，小鼠肺转移抑制率分别为44 %，64 %17.2.3 对免疫功能的影响 人参皂苷 Rh2 注射液可提高荷瘤小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬功能及血清溶血素抗体的生成能力, 提高小鼠 NK 细胞

15、杀伤活性和 IL2活性18.2.4 抗过敏反应 人参皂苷 Rh2 可明显抑制 IgE 诱导 RBL,2H3 细胞释放氨基己糖苷酶(IC50 为 0.1mmol/L)和小鼠被动皮肤过敏反应，且作用强于色甘酸钠.2.5 抗耐药作用 顺铂为临床广谱抗肿瘤药物，可诱导多种肿瘤细胞凋亡19.通过人参单体皂苷 Rh2 增强顺铂对 PC3M 致凋亡效应的研究发现，顺铂与 Rh2 联合应用可提高顺铂对前列腺癌细胞的诱导凋亡效应20.2.6 抗增生作用 在培养小鼠成纤维细胞过程中发现，人参皂苷 Rh2 对 DNA合成具有抑制作用21.【参考文献】1 金凤燮，鱼红闪，卢明春，等.人参皂苷实现工业化生产J.家庭医学

16、，2004(9)：5.2 蒋磊，卢明春，鱼红闪，等.人参皂甙 Rh2 产品质量检验及含量测定方法J.大连轻工业学院学报，2002，21(3)：197.3 冯林，曾宪斌，胡现辉.反相高效液相色谱法测定人参源胶囊中人参皂苷 Rh2 的含量J.食品与药品，2008，10(7)：35.4 顾轶，王广基，孙建国，等.LCMS 法测定 Beagle 犬血浆中人参皂苷 20(R)Rh2 及其药代动力学研究J.中国临床药理学与治疗学，2006，11(3)：256.5 方亮，戈延茹，郭建鹏，等.吸附树脂法测定梅花参芪精中人参皂甙的含量J.延边大学医学学报，1998，21(3)：165.6 王占峰，罗毅男，洪新雨

17、，等.人参皂甙 Rh2 抗肿瘤作用机制的研究J.北华大学学报:自然科学版，2005，6(1)：50.7 夏丽，娟韩锐.人参皂甙 Rh2 体外对小鼠黑色素瘤细胞的分化诱导作用J.药学学报，1996，31(10)：742.8 李殿友，罗毅男，杨红，等.人参皂苷 Rh2 诱导 C6 胶质瘤细胞的增殖抑制和诱导凋亡作用J.白求恩医科大学学报，2000，26(4)：342.9 李丽，齐凤英，刘俊茹，等.人参皂苷 Rh2 对食管癌细胞 Eca109 细胞周期的影响J.中国中药杂志，2005，30(20)：1617.10 周桂花，孟艳，李杨，等.人参单体皂苷 Rh2 对前列腺癌细胞株PC3M 细胞移行周期的

18、影响J.中国病理生理杂志，2002，18(7)：823.11 于光久，康健，郭风.人参皂苷 Rh2 对人喉癌细胞株 Hep2 抗增殖作用的研究J.锦州医学院学报，2003，24(6)：34.12 Oh M, Choi S, Chung H.Antiproliferating effects ofginsenoside Rh2 on MCF7 human breast cancer cellsJ.Int JOncol,1999,14(5):869.13 张丽娟.人参皂苷对卵巢癌细胞的影响J.国外医学 中医药分册，1996，18(4)：4.14 樊光华，姜浩，欧文胜.人参皂苷 Rh2 诱导人肿癌 Bel7404 细胞凋亡的作用J.实用癌症杂志，2003，18(1)：16.15 曾小莉，涂植光.人参皂苷Rh2 对人肝癌细胞 SMMC7721 信号传导的影响J.中华肝脏病杂志，2004，12(9)：565.16 李罗丝，罗志勇，文斌，等.人参皂苷 Rh2 对白血病 HL60 凋亡的诱导作用J.中国现代医学杂志，2006，16(21)：3215.17 陶丽华，高峰，刘红岩，等.20(R)人参皂苷 Rh2 抗癌细胞转移实验研究J.人参研究，2002，14(4)：17.18 葛迎春，李晨燕，任慧君，等.人参皂苷 Rh2 注射液对荷肝癌(H22)小鼠免疫功能的影响J.特产研究，2002(3)