微骨折结合bFGF纤维蛋白胶复合物修复关节软骨缺损的实验研究

1、微骨折结合bFGF纤维蛋白胶复合物修复关节软骨缺损的实验研究                             作者：魏昌海 李汉秀 郝清海【摘要】  目的 探讨微骨折结合碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor bFGF)与纤维蛋白胶复合物对关节软骨缺损的修复作用。方

2、法 选择健康成年新西兰大白兔24只，随机分为A实验组、B对照组、C对照组、D空白对照组，每组6只(12膝)，所有兔子均造成股骨髁间窝直径4 mm全层软骨缺损。A实验组：软骨缺损区造成微骨折并注入1 g bFGF和0.1 ml纤维蛋白胶的混合物； B组：软骨缺损区造成微骨折并注入0.1 ml纤维蛋白胶； C组：软骨缺损区注入1 g bFGF和0.1 ml纤维蛋白胶的混合物； D组：软骨缺损区注入0.1 ml纤维蛋白胶； 术后8、12周处死动物取标本每次每组3只(6膝)，大体观察膝关节活动度及修复组织与周边组织的结合情况，苏木素?惨梁烊旧?和甲苯胺蓝染色观察修复组织的形态。根据Wakitani评分

3、标准测定各组不同时间点标本光镜组织学评分，进行统计学分析。结果 术后8、12周大体观察与织学观察结果，实验组关节软骨缺损的再生修复均明显优于对照组，差异具有统计学意义(P<0.05)。结论 微骨折和碱性成纤维细胞生长因子都有促进软骨修复的作用，两者结合起来对软骨再生具有更明显的促进作用。 【关键词】  关节软骨； 软骨缺损； 微骨折； 碱性成纤维细胞生长因子    【Abstract】  Objective To study the effect of bFGF combined with microfracture on repair

4、of articular cartilage defect.Methods 24 New Zealand white rabbits were divided into group A,B,C and D randomly.The 4mm in diamete of full?thickness articular cartilage defects were made on femoral intercondylar fossa in all rabbits.Group A: microfracture was made on the cartilage defect and covered

5、 with 1 g bFGF and 0.1ml fibrin glue.Group B:the same microfracture was made on the cartilage defect and covered with the same dosage of fibrin glue.Group C：the cartilage defect was covered with 1 g bFGF and 0.1ml fibrin glue.Group D：the cartilage defect was covered with 0.1ml fibrin glue.The rabbit

6、s were killed in 8,12 weeks postoperatively,and the areas of cartilage defect were examined grossly,microscopically and histological scored.Results The cartilage regeneration in Group A was significantly superior to that in control group,there has a significant difference (P<0.05).Conclusion Micr

7、ofracture combined with bFGF plays an effective role in articular cartilage regeneration.    【Key words】  articular cartilage； cartilage defect； microfracture； basic fibroblast growth factor     由于关节软骨缺乏直接的血液供应、淋巴循环和神经支配，并具有低代谢的生理特点，关节软骨缺损后的自行修复能力非常有限，关节软骨缺损的修

8、复已成为临床骨科急需解决的问题之一。目前常用的是外源性修复方法，如钻孔术、骨膜和软骨膜移植、细胞移植、骨软骨移植等。随着分子生物学研究的进展，发现软骨缺损的修复过程是一个多种因子参与的复杂过程，其中细胞因子在软骨组织工程中是不可缺少的重要组成部分,包括刺激软骨细胞增殖的生长因子和刺激软骨细胞分化的细胞因子。碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)广泛存在于脑、垂体、肝、肾、骨、软骨、角质细胞、血管平滑肌细胞、成肌细胞、星形细胞等组织中，是重要的有丝分裂促进因子，也是形态发生和分化的诱导因子，在正常生理及病理过程中参与生长发育和组织损伤的修复过程，对中胚层及神经外胚层来源的细胞都有较强的促有丝分裂作用

9、，可促进间充质干细胞增殖、分化、增加修复细胞的数量1。为了观察bFGF对关节软骨缺损的修复，作者对其治疗关节软骨损伤进行了实验研究。    1  材料和方法    1.1  材料    健康新西兰大白兔24只(体重2.02.5 kg)； 纤维蛋白胶(哈尔滨瀚邦医疗科技有限公司)； bFGF(北京博奥森生物科技有限公司)。    1.2  方法    动物分组：将24只兔子随机分为A、B、C、D组。模型制备：用3%戊巴

10、比妥钠溶液按照1.0 ml/kg耳缘静脉注射麻醉，术区脱毛，碘伏消毒，取双膝内侧入路，显露髌股关节面，用直径4 mm 空心平头钻在股骨髁间窝正中上方造成全层关节软骨缺损区，深及软骨下骨以均匀出血为止。A组：用直径1 mm克氏针在缺损区钻孔，孔间距2 mm，共4孔用微量注射器先将1 g bFGF与0.1 ml纤维蛋白胶混合后充填缺损区，然后涂布0.1 ml氯化钙溶液促进凝胶形成。B组：软骨缺损区造成微骨折(同A)并注入0.1 ml纤维蛋白胶； C组：软骨缺损区注入1 g bFGF和0.1 ml纤维蛋白胶的混合物； D组：软骨缺损区注入0.1 ml纤维蛋白胶； 逐层缝合关闭，患肢不固定，放置笼内饲

11、养，任其自由活动。分别于8、12周处死动物，取材。    1.3  观察指标    1.3.1  肉眼观察  观察膝关节囊有无挛缩、粘连和新生物形成，以及关节活动度、修复组织的光滑性及其与周边组织的结合情况。    1.3.2  光镜组织学检查  将标本置于100 g/L甲醛溶液中固定，脱钙，梯度乙醇脱水，石蜡包埋后，切片行苏木素?惨梁烊旧?（HE）和甲苯胺蓝(TB)染色。光镜下对修复组织的性质、表面特性和与正常软骨连接等进行组织学观察。采用Wakitan

12、i4制定的评分标准（见表1），双盲法对各标本进行组织学评分，利用dunnet?t检验将评分结果进行方差分析。    1.4  统计学分析    结果采用SPSS10.0软件进行统计处理，实验数据以±s表示(见表2)，P < 0.05为有统计学意义。表1  各组不同时间点标本光镜组织学评分百事通    2  结果    2.1  实验动物膝关节大体观察    术后8、12周各组动物关节腔内均见

13、少许淡黄色、清亮的关节滑液，无软组织挛缩、粘连,滑膜无充血水肿，周围软骨无破坏和骨赘形成。术后8周，A组软骨缺损区被半透明、表面光滑的类软骨组织替代，与周围关节面平齐，有一定的弹性，与周围正常软骨的分界线清楚； B、C组外观相似，软骨缺损区被薄层白色组织填充，缺损区均未完全填平，表面呈白色，半透明、不光滑、质地软、弹性差，与周围正常软骨的分界线清楚。D组缺损区被薄层纤维斑痕组织覆盖，缺损明显。术后12周，A组表面光滑，呈白色，完全填平缺损区，肉眼观与周围软骨相比，质地、色泽近似，表面与正常关节面平齐，与周围正常软骨的界限基本消失； B、C组外观相似缺损区大部分被白色，半透明组织填充，外观与周围

14、关节面界限清晰，表面有小的突起，质地软、弹性差； D组缺损仍然存在，薄层斑痕增生，色泽灰暗，周围正常软骨的分界线清楚。    2.2  光镜组织学观察各组软骨缺损的修复情况    第8周，A组新生软骨组织细胞呈圆形和卵圆形，排列不规则，细胞密度大于正常软骨，软骨陷窝明显，表明修复组织大都为纤维软骨，仅少量软骨呈透明样，表面无严重的纤维化，且新生组织高于正常周围软骨平面（见图1）； B、C对照组新生组织细胞呈圆形或卵圆形，形成少量纤维软骨，无透明软骨形成，与周围组织界限明显（见图2）；D组软骨缺损区为斑痕组织覆盖含有少量软骨细

15、胞。第12周，A组缺损基本愈合，修复组织细胞密度显著降低，基质均匀，细胞形态和排列接近正常软骨，修复软骨呈透明软骨样(见图3)； B、C对照组缺损表面不光滑，软骨细胞排列不规则，细胞密度小于正常；D组形成大量的纤维瘢痕组织，仅有少量纤维软骨，无透明软骨形成，与周围分界明显（见图4）。表2  Wakitani评分标准    2.3  各组不同时间点标本光镜组织学评分    A、B、C、D数据利用dunnet?t检验将评分结果进行方差分析,P<0.05.A组关节软骨缺损的再生修复明显优于对照组B、C，D组，差异具

16、有统计学意义，B、C组明显优于D组差异具有统计学意义。    3  讨论    Calandruccio等1962年首次发现应用软骨下骨钻孔术可以治疗关节软骨缺损2。国外Shapiro(1993年)、国内葛志强3等以兔为实验对象，行软骨下骨钻孔术修复全层关节软骨缺损，实验证实缺损区有新生透明软骨修复，钻孔对关节功能无不利影响。1999年德国学者Steadman等4报告临床应用“微骨折”技术修复关节软骨缺损，即采用特制的骨刀在软骨下骨表面造成“微骨折”，以提供组织再生的适宜环境和激发自身修复潜能，使关节面得以修复，经随访疗效满

17、意。    碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)广泛存在于脑、垂体、肝、肾、骨、软骨、角质细胞、血管平滑肌细胞、成肌细胞、星形细胞等组织中,是重要的有丝分裂促进分子，也是形态发生和分化的诱导因子，在正常生理及病理过程中参与生长发育和组织损伤的修复过程。bFGF对中胚层及神经外胚层来源的细胞都有强烈的促有丝分裂作用，能在极低浓度水平(1 ngml)发挥活性5,对肢体发育和塑性尤为重要，对神经元的存活及突起的生长也有强的促进作用，此外还可刺激血管生长，软骨修复及骨折愈合等广泛的生物学效应。    在体内，生长分化因子要有载体的保护，以避免因

18、稀释或快速降解而失去其生物活性。因此，探寻具有保护和缓释作用的理想载体十分重要。纤维蛋白胶是由纤维蛋白原在凝血酶和钙离子作用下形成的凝胶物质，其作为软骨组织工程支架具有以下优点：水凝胶水分含量高，摩擦系数少，和软骨相似，事实上软骨是胶原、硫酸软骨素和其他多聚糖共同形成的水凝胶； 水凝胶基质通过保持软骨细胞外型而增强其功能； 通过水凝胶基质bFGF被均匀分配，防治其流失； 水凝胶有弹性、亲水性，亲水性物质可以自由扩散。纤维蛋白胶是天然水凝材料，具有无毒、无免疫型、可塑性好、具有良好生物相容性和生物降解性等优点，可以直接注射，便于关节镜下使用，是良好的生物载体。   

19、 本实验采用的克氏针手摇钻在软骨下骨表面形成微骨折，表现为骨小梁发生穿孔、断裂。微骨折后的修复组织主要来源于松质骨间充质细胞，属于外源性修复。软骨下骨出血由红细胞、白细胞和少量的未分化细胞组成。缺损形成后不久。纤维蛋白凝块迅速填充，同时松质骨内多种功能间充质细胞发生增殖。凝块可使骨释放生长因子，血小板也能释放多种可促进骨髓间充质细胞向软骨细胞转化的细胞因子。同时bFGF起到催化剂的作用，诱导骨髓间充质细胞向软骨细胞转化6。本实验可见从微骨折基底及孔隙壁缘的骨样组织进一步分化成为透明样软骨。    通过动物实验，在非负重的股骨髁间窝造成软骨缺损区，联合微骨折技术利用碱性成纤维细胞生长因子作为催化剂，诱导促进关节软骨的再生修复，与对照组相比软骨修复良好，证实了碱性成纤维细胞生长因子对诱导再生关节软骨的促进作用，为关节软骨的修复提供了新的方法。【参考文献】  1 Shid J，Jingushi s，Izumi T，et alBasic Fibroblast Growth Factor Stimulates Articular Enla