westernblot常见问题及处理总结

1、免疫细胞研究 western blotWestern Blot 常见问题及处理总结阿木1、western blot 的优点答：灵敏，可达ng级，用Ecl显色法理论上可达 pg 级。方便，特异性高。2、为什么我的细胞提取液中没有目标蛋白答： 原因有很多 : a) 你的细胞中不表达 这种蛋白质，换一种细胞； b) 你的细胞 中的蛋白质被降解掉了，你必需加入PMSF抑制蛋白酶活性；c)你的抗体不能识别目标蛋白，多看看说明，看是否有问题。3、我的细胞提取液有的有沉淀，有的很清亮，为什么呢答： a) 有沉淀可能因为你的蛋白没有变 性完全， 可以适当提高 SDS 浓度，同时将 样品煮沸时间延长， b) 也

2、不排除你的抗 原浓度过高，这时再加入适量上样缓冲液 即可。4、我做的蛋白质分子量很小(10KD，请 问怎么做 WB答：可以选择 卩ml的膜，同时缩短转移时间。也可以将两张膜叠在一起， 再转移其他按步骤即可。5、我的目的带很弱，怎么加强答：可以加大抗原上样量。 这是最主要的同时也可以将一抗稀释比例降低。6、胶片背景很脏，有什么解决方法答：减少抗原上样量，降低一抗浓度，改变一抗孵育时间，提高牛奶浓度。7、目标带是空白，周围有背景，是为什么答：你的一抗浓度较高，二抗上HRP催化活力太强，同时你的显色底物处于一个临 界点，反应时间不长， 将周围底物催化完， 形成了空白即“反亮现象”。将一抗和二 抗浓度

3、降低，或更换新底物。、我的胶片是一片空白，是怎么回事答：如果能够排除下面的几个问题那么问题多半出现在一抗和抗原制备上。a) 二抗的HRP活性太强，将底物消耗光；b) ECM底物中H2O2不稳定，失活；c) ECL 底物没覆盖到相应位置； d) 二抗失活。9、我在显影液中显影 1 分钟和 5 分钟后 ,底片漆黑一片 , 是什么原因呢答： a) 可能是红灯造成的 , 胶片本来就 被曝光了，可以在完全黑暗的情况下操作 看是否有改善 . ； b) 显影时间过长。10、DAB好还是ECM子答：DAB有毒，但是比较灵敏，是 HRP最 敏感的底物；ECM吉果容易控制，但被催 化时灵敏度差一点，但如果达到阀值

4、，就 特别灵敏，可以检测 pg 级抗原。要看你 实验的情况。11 、抗原检测出的分子量比资料上的大， 是怎么回事答： a) 抗原形成了二聚体。增多巯基乙醇 量，煮沸变性时间延长， 可以打开二聚体b） 蛋白本身的修饰如：糖基化，磷酸化等12、蛋白转移不到膜上，但胶上有，同时 Marker 转上去了，为什么答：可能是：a）样品浓度过低；b）转移时间不够，。13、磷酸化抗体的检测样本制备时是否一 定要加NaF等答：NaF是一种广谱磷酸化酶的抑制剂，一般最好加。但是不加也可以，大部分时候是不用加的。14、要验证某个细胞上有无该蛋白的存在，需要做免疫组化和 western blot 试验吗做这两个试验时

5、的一抗和二抗可以共用吗答： 免疫组化可以用来进行定位，但 是不能精确定量，而且有时会有假阳性， 不易与背景区分； Western blot 可以特异 性检测某个蛋白质分子，进行定量，但是 不能定位。 两种实验的一抗有时候不能通用，公司的产品说明一般都会说明可以进行什么实验，在免疫组化时，是否适合石蜡切片或者冰冻切片。15、做 Western Blot 时，提取蛋白后冻 存（未加蛋白酶抑制剂） ，用的博士德的 一抗，开始还有点痕迹，现在越来越差， 上样量已加到120卩g,换了个santa cloz 的一抗仍不行。是什么原因蛋白酶抑制剂 单加PMSF亍吗 答：怀疑是样品问题，可能是： 1，样品 不

6、能反复冻融； 2，样品未加蛋白酶抑制 剂。同时，建议检查 Western Blot 过程， 提高一抗浓度。对于加蛋白酶抑制剂来说，一般加PMSF就可以了，最好能多加几中种蛋白酶抑制剂。16、细胞水平要做 western blot ，多少细胞提的蛋白够做 western blot答：一般5X 10人6就足够了17、同一样品能同时提RNA又提蛋白么这样对 western blot 有无影响答：能，没有问题。同一蛋白样品能同时进行两种因子的Western Blot 检测吗答：当然可以，有的甚至可以同时测几十种样品。19、如果目标蛋白是膜蛋白或是胞浆蛋白，操作需要注意什么答：如果是膜蛋白和胞浆蛋白，所

7、用的去垢剂要温和得多，这时最好加上 NaF去抑 制磷酸化酶的活性。20、我的样品的蛋白含量很低，每微升不 到 1 微克，但是在转膜时经常会发现只有 一部分蛋白转到了膜上，就是在转膜后染 胶发现有的孔所有的蛋白条带都在，只是 颜色变淡了，有什么办法可以解决 答：你可以加大上样量，没有问题，还有 转移时你可以用减少电流延长时间，加 20甲醇。21、想分离的蛋白是分子量 200kd 的，SDS-PAG电泳的分离胶浓度多大合适积 层胶的浓度又该用多少这么大分子量的 蛋白容易作 Western Blot 吗答：200kd的蛋白不好做，分离胶用7%,积层胶 22、如果上样量超载，要用什么方法来增加上样量答

8、：可以浓缩样品，也可以根据你的目标 分子量透析掉一部分小分子蛋白。一般 地，超载 30是不会有问题的。 如果已经 超了不少了，而且小分子量的也要，可以 考虑加大胶的厚度，可以试试的。23、蛋白变性后可以存放多久答：OC, 两年没有问题。最关键两条：不要被蛋白酶水解掉；不要被细菌消化掉（也是被酶水解了 ） 。24、我所测定的蛋白分子量是105KD按 理说分离胶应当采用 %，但资料却要求分 离胶和浓缩胶均采用 1 1的配方，不知为 何答：上述提到的两种凝胶均可以使用，因为105KD的蛋白在上述两种胶的线性分辨范围内，但需注意条带位置。25、二抗是生物素化的抗体，三抗是亲和素生物素体系，不知采用这样

9、的方案后， 封闭液是否要作调整，能否再用 5的脱 脂奶粉呢好像有资料说脱脂奶粉会影响 亲和素生物素的生成，是吗 解答：不能使用脱脂奶粉，因为脱脂奶粉中含生物素，用BSA代替应该好一点.26、问一般一次上样的蛋白总量是多少，跟目的蛋白的表达量有关系吗答：Western Blot 般上样 30 - 100 微克不等，结果跟目的蛋白的丰度、上样量、 一二抗的量和孵育时间都有关系，也与显 色时间长短有关。开始摸条件时，为了拿到阳性结果，各个步骤都可以量多一点时 间长一点，当然背景也就出来了。要拿到 好的结果，如果抗体好的话比较容易，抗 体不好的话就需要反复地试了，当然有的 不适合 Western Bl

10、ot 的怎样做也不行。27、做组织样品的 western 的时候，怎样处理样品答：必须进行研磨、匀浆、超声处理，蛋 白质溶解度会更好，离心要充分，膜蛋白 需用更剧 烈的方法抽提，低丰度膜蛋白 可能还要分步抽提 （超速离心 ） 。还有一点 就是组织中的蛋白酶活性更强，需要注意 抑制蛋白酶的活性（加入PMSF）。28、问大分子量蛋白200KD 在做 western要注意什么呢答：做 200kd 蛋白的 Western Blot 时要注意，分离胶最好选择 >7%的；剥胶时要小心；转移时间需要相应延长；要做分子 量参照（否则出现杂带不知道如何分析）29、有什么方法可以提高上样量答：a）可以浓缩样

11、品；增大上样体积来增 大上样量；b）用5倍的上样缓冲液来稀释 30、蛋白的上样量有没有什么具体的要求答：上样量要根据实验的要求来定， 如果要求是定量和半定量的 Western Blot则上样量要均等，如果只是要定性，则没有太大的关系， 尽量多上就行了， 但是不要超载 .31、一抗，二抗的比例是否重要答：比较重要，调整好一抗， 二抗的比例， 可以去掉部分非特异的本底。32、要做磷酸化某因子 Western Blot ，其 二抗有何要求答：对二抗无要求，要看你实验条件来选 择，一般推荐用HRF标记的二抗。33、免疫组化和 Western Blot 可以用同一种抗体吗答：免疫组化时抗体识别的是未经变

12、性处 理的抗原决定簇（又称表位） ，有些表位 是线性的，而有的属于构象型；线性表位 不受蛋白变性的影响，天然蛋白和煮后的 蛋白都含有；构象型表位由于受蛋白空间 结构限制，煮后变性会消失。如果你所用 的抗体识别的是蛋白上连续的几个氨基 酸，也就是线性表位，那么这种抗体可同 时用于免疫组化和Western，而如果抗体 识别构象形表位，则只能用于免疫组化。34、 Western Blot 中抗体的可以重复应用吗答：抗体工作溶液一般不主张储存反复使 用，但是如抗体比较珍贵，可反复使用 2 3次。稀释后应在 23天内使用， 4度 保存，避免反复冻融。35、在做 Western Blot 时，PVDF膜用

13、甲醇浸泡的目的答：PVDF膜用甲醇泡的目的是为了活化PVDF莫上面的正电基团，使它更容易跟带负电的蛋白质结合，做小分子的蛋白转移时多加甲醇也是这个目的。36、检测同一抗体的磷酸化和非磷酸化的 抗原可以在同一张膜上吗答：可以。37、转膜后经丽春红染色的条带，为什么大蛋白分子的一端的转膜好象不是很好， 为什么答：这是正常的，大分子的蛋白转移的慢，你延长转移时间和电流，大分子一端就会好的多，但是小分子的就有可能会变淡。38、做 Western Blot时，同样的抗体免疫组化能做出，而 Western Blot 却不能 答：这多半是抗体的问题，要看抗体的说 明，是否能做 Western Blot 和免

14、疫组化39、如果是6X8转印膜，要加多少一抗答：一抗的稀释度是有说明的，根据你的 一抗看看就知道了，但是那么大的膜孵育 体积一般最少为 35ml。40、上下槽缓冲液有何要求，怎样才能达到最佳效果答：无特殊要求。但我们一般是上槽放新鲜的缓冲液，下槽可以是重复使用过一两 次的缓冲液41、跑电泳的时候配的胶总是“缩”是什 么原因呢是有的成分不对吗答：没什么问题，就是你胶里的水分被蒸 发了。过夜时拿保鲜膜包起来，在里面加 点水保持湿度就可以了； 也可能母液 （30% 聚丙酰胺）有问题，你可以重新配制一份 观察；能够替换的试剂，尽量换一下，选 用好的试剂。42、蛋白质的分子量跨度很大，如要分离小21KD

15、中至66KD大至170KD可以一次做好吗答：这么广的分布不好转移，一般建议：21kd 和 66kd 可以一起转，12% SDS-PAGJE湿转 120mA， 45-60min 就可以了， 可以根据你实验室的经验调节； 170kd 用7%SDS PAGE， 200mA 90-120min。43、不能很好地将大分子量蛋白转移到膜 上， 转移效率低怎么样解决答：可以考虑：转移缓冲液中加入 20%甲 醇（是指终浓度），因为甲醇可降低蛋白 质洗脱效率，但可增加蛋白质和 NC膜的 结合能力，甲醇可以防止凝胶变形，甲醇 对高分子量蛋白质可延长转移时间；转移 缓冲液加入终浓度 %SD，S 也是为了增加转 移效

16、率；用优质的转移膜，或使用小孔径 的NC膜（微米）.44、我用的是可视 marker ，但是电泳总跑不全条带，请问什么原因怎样改善胶用%，12%，都是这样marker是新买的答：一般来说，是小分子量 Marker 跑走 了，增加胶浓度或减少电泳时间试试看。当然梯度胶也是不错的选择。45、是否 Western Blot 实验半定量一定要加ACTIN内参答：对于发表文章的实验最好加内参，实验严谨。46、核内抗原 Western Blot 内参选择什么合适答：可以选用组蛋白，组蛋白在细胞核中 的表达是很稳定的，有很多都可以当成内 参，在网上查查就可以选出你要的内参。47、做半定量 Western B

17、lot ，内参B -actin , GAPD哪个好答：选用 beta-actin 就可以48、想问一下细胞裂解液选择蛋白酶抑制剂时有什么原则吗受不受组织来源的影响胞膜和胞浆有区别吗答：一般来说提取时加入广谱的蛋白酶抑 制剂就可以了，操作时保持低温。除非有 文献特别指明用特殊的方法，一般来说都 没有区别。49、转膜后的脱脂奶粉封闭液是 5%的 TBST 脱脂奶粉”，其中TBST最后那个T是 Twee n吗，浓度多大答：是 Tween 配方如下：Tris-Buffered base： 加水 800ml 溶解 , 加 500-1000ulSaline Tween-20 (TBST), NaCl：g， Tris的 Tween-20, 用 HCl 调节 pH 至 , 加水 定容至 1L.50、封闭，一抗，二抗时的温度有没有什 么规定呢，比如在室温里做，或者要在 4 度下 答：均可在室温进行，如果时间不够，一 抗孵育可以先在室温进行一个小时，然后 4 度过夜。51、请问一下PVDF膜和硝酸膜结合蛋白的原理是什么答：一般而言，硝酸纤维素膜是通过疏水 作用来和蛋白质相联，这样的话，反复洗 几次后，蛋白容易掉下来，结果较差。PVDF 膜主要通过它膜上的正电荷和蛋白接合， 同时也有疏水作用，但相对较弱。这样的 话，PVDF膜和蛋白接合较牢，不易脱落， 结果