重组人G－CSF免疫小鼠全套单链抗体噬菌体表面展示文库的构建

1、    重组人GCSF免疫小鼠全套单链抗体噬菌体表面展示文库的构建        关键词GCSF单链抗体噬菌体表面展示基因文库摘要利用全套噬菌体抗体表面展示技术，绕过杂交瘤技术，从重组人GCSF免疫的小鼠脾淋巴细胞中提取总RNA，反转录成cDNA后，用抗体可变区PCR混合引物进行全套抗体重、轻链可变区（VH和VL）基因的扩增。经重叠延伸反应，在体外随机装配成单链抗体（ScFv）。将其克隆至噬菌粒载体pCANTAB5E中，电转化含SupE的E.coli菌株，以辅助噬菌体M13K

2、O7超感染噬菌粒文库，构建成全套ScFv表面展示文库。为利用亲和富集筛选技术，获得具有GCSF结合活性的完整重组噬菌粒克隆奠定了基础。中国书资料分类号R392.11Q78Construction of a phage display library of repertoire singlechain Fv antibodies from mouse immunized with recombinant human granulocytecolonystimulating factor (GCSF) Jia Songhui , Guo Yao1 (Department of Pathophysi

3、ology, 1Department of Radiation Medicine, the Fourth Military Medical University, Xian 710032) Fan Lingzhi, Liang Mifang, Hou Yunde (National Laboratory of Molecular Virology and Genetic Engineering, Chinese Academy Preventive Medicine) Keywords GCSF singlechain Fv antibody phage display cDNA librar

4、y Abstract Using phage display technique we constructed a library of repertoire immunoglobulin from mouse immunized with recombinant human granulocytecolony-stimulating factor (GCSF). The heavy-chain and kappa lightchain variable region gene (VH and VL) repertoire of immunoglobulin were amplified in

5、dividually from the spleen cell mRNA by RTPCR and joined by a DNA linker encoding peptide (GGGGS)3 as a single? chain Fv (ScFv) DNA fragment with overlap extension. These fragments were cloned into the phagemid pCANTAB 5E and expressed as a fusion protein with phage M13 P in E.coli TG1.In the presen

6、ce of helper phage M13KO7, the ScFv fusion protein were displayed on the surface of recombinant phages. 粒系集落刺激因子（GCSF）具有特异地刺激和调节粒细胞系统增殖、分化、存活和活化等作用1，在放射损伤的救治及肿瘤患者放、化疗的辅助治疗等方面具有重要作用。但由于嗜中性粒细胞在组织内的大量聚积和激活，可通过“呼吸爆发”效应释放出大量氧自由基等多种成分，在清除异己的同时也将对自身组织产生严重损伤。这已成为多器官功能衰竭、成人呼吸窘迫综合征及全身性炎症反应综合征等严重病理过程的一个重要机制2。因

7、此，保持体内粒细胞的动态平衡是对一些临床疾病诊治的重要环节。由于粒细胞的激活和释放反应受多种因素（包括多种细胞因子）的影响和调节3，而GCSF则能够特异性地刺激和调节粒细胞系统的增殖和活化，因此，研究其在炎性抗炎性细胞因子网络中的作用及地位就十分必要。其中研制和应用抗GCSF抗体将是一个重要的途径。本实验利用90年代发展起来的全套抗体噬菌体表面展示系统4，绕过杂交瘤技术，从重组人GCSF免疫小鼠脾淋巴细胞mRNA出发，利用重叠延伸反应在体外随机拼接抗体可变区基因，最终构建了全套单链抗体（ScFv）噬菌体表面展示文库，为利用亲和富集筛选技术，获得具有GCSF结合活性的完整重组噬菌粒克隆奠定了基础

8、。1材料和方法1.1材料噬菌粒载体及辅助噬菌体噬菌粒载体pCANTAB5E，为Pharmacia公司产品。其中含有氨苄抗性基因（Ampr）,Plac启动子及M13噬菌体间隔区片段,用于克隆ScFv基因的Sfi，Not克隆位点及Etag序列和瑚珀终止码TAG。辅助噬菌体M13KO7，为Pharmacia公司产品，带有突变型基因、质粒复制起点和卡那霉素抗性基因（Kanr）,在其辅助下可使前者产生含单链噬菌粒基因组的噬菌体颗粒。细菌菌株E.coliTG1为Pharmacia公司产品，用于ScFv噬菌体表面展示。PCR反应系统TagDNA聚合酶和dNTP,为德国Boehringer Mannheim产

9、品；PCR引物为Pharmacia产品，其中Heavychain primer1和2分别为VH基因5端和3端引物，用来扩增鼠IgVH基因。Lightchain primer mix为10种VL基因5端和3端引物的混合物，用来扩增鼠IgVL基因。Linker primer mix为含有两条互补、各有93个碱基序列、带有Linker(GGGGS)3序列的VH基因3端和VL基因5端引物的等摩尔数混合物。该引物两端的各24个碱基分别与VH和VL基因的3端和5端相互补，从而可将VH和VL基因片段拼接成ScFv基因。RS primer mix为带有Sfi位点的重链基因5端引物和带有Not位点的轻链基因3端

10、引物的混合物，用来扩增ScFv基因片段同时引入克隆位点。试剂TRIzol试剂、cDNA合成试剂及各种限制性核酸内切酶等,分别为Boehringer Mannheim公司、Pharmacia公司、Biolabs公司、Life Technologies公司或华美公司产品；G-CSF为军事医学科学院邦定公司产品（纯度大于95且不含白蛋白保护剂）。1.2方法动物免疫出生后6周龄雌性Balb/c小鼠10只（中国医学科学院动物繁育场提供）体重17g20g，适应性饲养1周后，随机分为5组，每组2只。分别以5g，10g，20g和50g等不同剂量GCSF加福氏完全佐剂（等体积）进行初次免疫。对照组以生理盐水代替

11、GCSF。3周后进行第2次免疫，以GCSF（剂量同前）加福氏不完全佐剂（等体积）皮下多点注射。第6周时进行第3次免疫，以GCSF（剂量同前）不加佐剂腹腔注射。第7周时，取小鼠血清以常规ELISA法检测抗体滴度。滴度达110000后，立刻进行第4次免疫，以加倍剂量的GCSF不加佐剂腹腔注射。第8周以GCSF（剂量同前）进行加强免疫，不加佐剂腹腔注射，连续免疫3d。小鼠脾细胞总RNA的提取加强免疫结束后，取免疫效果较好的小鼠1只立即处死，迅速取出脾脏，按TRIzol试剂说明书要求提取细胞总RNA。逆转录合成cDNA第1条链参照Boehringer Mannheim公司的逆转录系统产品说明书，以总R

12、NA为模板，OligodT(15)为引物，在逆转录酶的催化下合成cDNA第1条链。全套VH和VL基因的扩增以逆转录合成的cDNA第1条链为模板，按下列体系分别进行全套VH和VL基因的扩增。扩增全套VH基因：模板5l,Heavy-chain primer1和Heavy-chainprimer2各1l,dNTP(2.5mmol/每种核苷酸·L)4l,10×PCR缓冲液5l,无菌双蒸水33l。于100预变性5min,0冰浴5min后,加TagDNA聚合酶5U(1l)。扩增全套VL基因:除应用Lightchain primer mix2ml代替上述引物外，其它均相同。PCR反应参数

13、为：9445s,551min,721min,30个循环后，72延伸10min。将PCR产物进行1.5琼脂糖凝胶电泳，用MicroSpin columns柱回收目的基因片段。全套VH，VL基因的随机拼接纯化回收的VH，VL基因片段，用VHmarker在紫外灯下定量分析后，与Linker primer mix以相同或接近等摩尔浓度混合，按下列体系进行连接PCR反应：纯化VH和VL基因的PCR产物各50ng,Linker primer mix4l,10×PCR缓冲液5l,dNTP(10mmol/每种核苷酸·L)4l,以无菌双蒸水补充至总体积为50l。100预变性5min,0冰浴5

14、min后,加TagDNA聚合酶5U(1l)。PCR反应的参数为:941min,634min，循环7次后延伸5min,从而将全套VH,VL基因随机拼接成ScFv。 全套ScFv基因的第2次PCR扩增 准备下列反应体系：TagDNA聚合酶5U(1l)，10×PCR缓冲液5l，dNTP(10mmol/每种核苷酸·L)2l，RSprimermix4l，无菌双蒸水38l。将上述反应体系加入7次循环后的PCR管内，继续进行30次循环。循环条件为:941min,551min又30s,722min。循环结束后,72延伸10min。全套ScFv基因的克隆将第2次PCR扩增产物加至含有Seph

15、acrylS400HR树脂的MicroSpincolumn柱内进行回收。对所获纯化的ScFv基因片段用Sfi和Not消化，再次用相同方法纯化回收。经用ScFvmarker定量分析后，将全套ScFv基因片段与pCANTAB5E载体在T4DNA连接酶(5U7U)作用下进行连接。同时做载体自连和阳性插入(controlinsert)。制备电转化的E.coliTG1感受态细胞。取2l连接产物加入100l电转化的感受态菌液中,在E.colipulser电转化仪中进行转化。将转化产物加入至37预温的1mlSOC培养液中，温浴1h后，取100l涂于SOBAG（含有100mg/L氨苄青霉素和2葡萄糖的SOB培

16、养基）琼脂板上，30培养24h。全套ScFv基因的噬菌体表面展示及鉴定从生长良好的SOBAG平皿上,挑取22个单菌落快提质粒进行酶切鉴定后，用2×YTAG（含有100mg/L氨苄青霉素和2葡萄糖的2×YT培养基）5ml将板上所有菌落洗下。取部分菌液用2×YTAG10ml稀释至A600为0.2后，于37振荡培养(250r/min)1h。至对数生长期后，加入5×1010pfu的M13KO7辅助噬菌体，37振荡培养1h。4000r/min离心10min，弃上清后将沉淀细胞再悬浮于10ml2×YTAK（含有100mg/L氨苄青霉素和50mg/L卡那霉素

17、的2×YT培养基）中，37振荡培养（250r/min）过夜。5000r/min离心20min，收集上清即为全套ScFv基因的噬菌体表面展示文库。将所得文库做108，109，1010，1011和1012梯度稀释，进行噬斑培养实验，观察噬斑生长情况以判断ScFv基因噬菌体表面展示文库的滴度。2结果2.1全套VH，VL基因片段的扩增和鉴定以逆转录合成的cDNA第1条链为模板，加入针对鼠IgV区基因不同家族的重链和轻链可变区引物进行PCR，即得到了全套抗体VH和VL基因。电泳结果显示，扩增出的VH和VL()基因片段约为350bp，VH略大于VL(1)，与预期的片段大小相符。1VH和VL基因P

18、CR扩增产物的凝胶电泳Fig 1 Gel electrophoresis of PCR products of VH and VL genes M: pBR322/Hinf marker 1613, 517, 506, 396, 344, 298 and 220 from top to bottom; H: VH gene fragment ; L: VL gene fragment 2.2全套ScFv基因的拼接和PCR扩增将纯化回收后的VH和VL基因片段，经过定量(VH：50ng/12l,VL:50ng/20l,总体积32.5µl）后，与等摩尔深度的Linker-Primer混合。

19、经7次重叠延伸反应，可将VH,VL基因片段随机连接成VH-Linker-VL(SeFv)。以此为模板，再以带有Sfi I位点的VH基因5端引物和不定期有Not I位点的JK基因3端引物，对SeFv进行第2次PCR扩增，从而获得全套SeFv基因，并引入了用于在pCANTAB 5E中进行克隆的限制性内切酶Sfi I和Not I位点。电泳结果表明720bp，350bp扩增产物约为左右的条带可能为未拼接上的VH或VL基因片段（2）2 全套ScFv基因PCR扩增产物电泳 Fig 2 Gel electrophoresis of PCR products of repertoire ScFv gene M

20、: pBR322/Hinf marker; ， : ScFv PCR products 2.3全套ScFv基因的克隆和文库构建经Sfi和Not消化后，将纯化的ScFv基因克隆入pCANTAB5E载体中。以全部连接产物电转化E.coli TG1，在氨苄青霉素选择性固体培养基上筛选转化的菌落。在载体自连对照和无连接产物转化菌的平皿上，均无单菌落生成；而在阳性插入对照和连接产物转化菌平皿上，均见大量单个菌落形成。随机挑选22个单菌落制备噬粒DNA，以EcoR和Hind双酶切鉴定，有15个单菌落所提噬菌粒DNA切出了约为2.1kb的条带（含有外源插段），与预测结果一致（3），表明克隆基本成功。噬菌粒文

21、库经过M13KO7超感染后，产生的重组噬菌体颗粒可释放于细菌培养上清中，经噬斑计数，滴度为7×1011pfu。3 ScFv重组噬菌粒克隆的酶切鉴定Fig 3 Identification of recombinant phagemid ScFv by EcoR I and Hind digestion M: DNA/Hind marker; 1-15: Products of EcoR I and Hind digestion 3讨论从人或动物淋巴细胞中，用PCR扩增出全套抗体可变区基因片段，并将其插入噬菌粒载体中，构建成全套抗体可变区基因或Fab段基因文库。在辅助噬菌体的帮助下，将

22、抗体分子片段展示于噬菌体表面，使抗体的表型和基因型联系为一体5，可为利用其与固相化抗原的结合活性进行筛选并获得所需的抗体片段和基因，从而绕过杂交瘤技术甚至免疫过程，直接从B细胞制备抗体奠定了基础。由于phage display技术的不断发展和完善，尤其是多年来人们对噬菌体分子生物学特性深入研究所构建的多种噬菌体载体的出现6，使这一技术得到广泛地应用。但在实际应用过程中，还存在多方面的问题，需要人们加以注意，尤其在全套VH，VL基因随机PCR拼接成ScFv方面。应用TRIzol RNA提取系统，可以很好地稳定获取总RNA，通过逆转录系统得到基因组cDNA。作为全套抗体库克隆技术的重要环节，要求P

23、CR扩增出的全套抗体V区基因能够反映免疫球蛋白的多样性。从理论上讲，应使其中每种V区基因都获得扩增，这样便可通过选用混合引物加以保证。如果构建的文库不够大，将有可能筛选不到所需的抗体基因，但可通过采用高转化率的电穿孔法加以克服。因此，构建全套噬菌体ScFv抗体库的第1个限速环节，是在体外将VH，VL基因随机拼接成ScFv。我们严格按照Pharmacia产品使用说明书，精确地进行了VH，VL和linker3种片段的定量，并将3种片段以等摩尔数混合进行重叠延伸反应。理论上应该获得良好的ScFvPCR产物，但实际操作上有很多细节值得推敲。在较长时间内，我们都未获得理想的ScFv PCR产物，偶尔有1

24、次出现结果，但产量较低且重复性不好。经大量地比较和分析实验，在改变了所用试剂和几个关键参数后，成功地获得了ScFv的PCR产物。修改后的方案稳定性好、易于重复。另外，由于全套VH，VL基因以ScFv形式展示于噬菌体表面，从而可用于筛选抗原。而ScFv是通过重叠延伸反应将全套VH，VL基因与Linker随机拼接形成的，因此，随机拼接的正确与否，直接影响到ScFv的空间构像和读码框架的正确性，并可直接影响下一步的亲和筛选。此外，目的基因片段与噬菌粒载体的连接也是一个需要注意的环节，否则会直接影响库容及含正确基因片段克隆的数量，而增加筛选的难度。  炎症过程中常涉及到粒细胞的增多，预先给小

25、鼠体内注射内毒素或用细菌感染细胞，均可在血清中检测出GCSF，如人和小鼠巨噬细胞用细菌内毒素刺激后，均可产生GCSF7。伴随炎症反应而产生的IL1和TNF，也可刺激成纤维细胞和内皮细胞产生GCSF，从而在炎症反应中出现大量的中性粒细胞。因此，血清中GCSF的增多与炎症反应时粒细胞的聚集密切相关。由于中性粒细胞的大量增加与激活可对自身组织产生严重损伤8，9，因而细胞因子作用的双重性应予重视。诚然，中性粒细胞的粘附和聚集是一个涉及多方面的过程，但应用抗GCSF抗体将是维持体内粒细胞动态平衡的途径之一。本文库的构建对进一步筛选具有中和活性的抗GCSF ScFv奠定了基础。作者简介：贾松惠，男，38岁

26、，讲师，博士西安市长乐西路17号，Tel.(029)3374551作者单位：贾松惠（第四军医大学病理生理学教研室,西安710032）郭鹞（第四军医大学防原医学教研室,西安710032）范灵芝梁米芳侯云德（中国预防医学科学院病毒基因工程国家重点实验室）参考文献1Zsebo KM, Cohen AM, Murdock DC, et al. Recombinant human granulocyte colonystimulating factor; molecular and biological characterization. Immunobiol, 1986; 172:175187 2Fujishma S, Aikama N. Neutrophil mediated tissue injury and its modulation. Intension Care Med, 1995; 21:277285 3Liu M, Slutsky AS. Antiinflammatory therapies: application of molecular biology techniques in intensive care medicine. Intensio