穴位埋药线和电针干预对脑缺血再灌注大鼠海马热休克蛋白70表达的影响

1、穴位埋药线和电针干预对脑缺血再灌注大鼠海马热休克蛋白7070表达的影响作者：孔立红，高珊，陈振江，彭松【摘要】目的观察局灶性脑缺血再灌注大鼠海马热休克蛋白70(HSP70)表达及川茸嗪缓释剂穴位埋药线和电针干预对其的影响。方法将SD大鼠随机分为正常组、假手术组、模型组、电针组、穴 位埋药线 组。采用改良线栓法制备局灶性脑缺血再灌注模型 及以胶原川劳嗪制备的缓释剂(药线)在大椎、双侧内关穴位埋药线。应用免疫组化方法检测不同时相(24、72、120 h)各组大鼠海马HSP70的表胞，治疗各组大脑海马HSP70表达均增加，24 h时HSP70阳性细胞数达到高峰，以后逐渐下降，与模型组比较差异有统计学

2、意义(PV(作者:单位:邮编:达。结果正常组及假手术组大鼠海马仅见少量HSP70卩日性细0.01)o其中穴位埋药线组大脑海马HSP70表达最为明显，与电针组 比 较差异有统计学意义(PV0.05)。结论川茸嗪穴位埋药线可诱导脑 缺血 再灌注后HSP70表达，进而抑制细胞凋亡，作用优于电针组。【关键词】局灶性脑缺血；川茸嗪；穴位埋药；电针；大鼠海马;热休克蛋白70Abstract: Objective To observe the effects of embedding impla ntatio n of collagen and Tetramethylpyraz ine in acupo i

3、nts and electroacupuncture on the express!onof HSP70 in hippocampus of rat with focal cerebral ischemia reperfusion. MethodsSD rats were ran domly divided in to no rmal group, sham operati on group, modelgroup, electroacupuncture group, embedding medicine in acupoints group. Model oflocal ischemia w

4、as made by middle cerebral artery occlusi on, preparati on of implantati on collage n and electro- acupuncture andTetramethyl pyrazine was embedded in the acupo ints of Dazhui andNeigua n two-sided. The expressi on of HSP-70 protein in hippocampus of different time poi nt (24, 72, 120 h) was assayed

5、 by immun ohistochemistry. Results Therewere only few positive cells of HSP-70 in normal group and sham operation group.The expressi on of HSP-70 in each therapy group were all heighte ned, and achievedthe peak 24 h later and the n decii ned in brain tissue after focal cerebralischemiareperfusio n,

6、the differences were relatively prominent com pared with thesame p base model group (P v 0.01). The exp ressi on of HSP-70 in creased in embedding medic ine group sig ni fica ntly compared with the electro-acupuncture group(P v 0.05). ConclusionEmbeddi ng implan tation of collage n and Tetramethyl p

7、yrazine in acupo ints canin crease the exp ressi on of HSP-70 in hippo cam pus of rats with cerebral ischemiareperfusion, which may protect neuronal cells after cerebral ischemia reperfusionin rats.Key words : cerebral ischemia reperfusion ;Tetramethylpyraz ine ； embeddi ng medic ine in points ; ele

8、ctroacupuncture : rathippocampus ; HSP-70川劳嗪对急慢性缺血性脑血管病具有肯定的治疗效果。 胶原药物缓释剂的研究及应用在国内外都取得显著成效。热休克蛋白70(HSP70)是脑缺血后应激反应合成的特殊蛋白质之明它是神经损伤的一种早期指标1 O HSP70表达增强，能减轻脑缺血后的神经元损伤，是缺血损伤时敏感而可靠的指标2。因此，我们以胶 原川茸嗪制备缓释剂(药线)在大椎、 双侧内关穴埋药， 电针大椎、 双侧 内关穴，观察埋药和电针后对HSP70表达的影响。1材料与方法1.1动物及分组清洁级健康SD大鼠98只，雌雄不限,体重为(200 i20)g,由华中科技

9、大学同济医学院实验动物中心提供。于实验前1周一次性购进，饲养于安静、温暖且避强光的环境中，室温(22 2)C,自由饮水进食。随机分为5组：正常组6只，假手术组、模型组、电针组、穴位埋药线组， 各18只。余下20只以造模备用。，多项研究表1.2胶原川茸嗪缓释剂(药线)的制备采用酸溶解法从大鼠尾腱提取胶原蛋白3,与川茸嗪(北京市永康药业有限公司)按照2 1比例制成药线，常温干燥，紫外线照射消毒，备用。1.3试剂及主要仪器HSP70单克隆抗体、DAB显色试剂，购自北京中山生物有限公司。日产Olympus光学显微镜；日产Nik on数码照相机。1 4大鼠局灶性脑缺血再灌注模型复制及筛选选择直径为0.2

10、6-0.28 mm单股缝合尼龙线，长60 mm,将 插入端加热熔化，使之成为光滑球面，直径约0.30 mm,用酒精清洁后 置于生理盐水中备用。局灶性脑缺血再灌注模型的建立采用改良线栓法4。大mL/100 g)进行腹腔麻醉并保温。麻醉大鼠仰卧固定于手术台上， 常规 皮肤消毒后，颈部正中切口，暴露右侧颈总动脉(CCA),分离岀颈内动脉(ICA)、颈外动脉(ECA)o电凝ECA入脑分支，结扎游离ECA主干，分 离ICA主干至翼腭动脉(PPA),并在其起始部位置一动脉夹。先将CCA用动脉夹夹住，再在ECA残端剪0.2 mm的小口，将栓线插入。轻推尼 龙线 尾端经CCA分叉部沿ICA入颅,至大脑中动脉(

11、MCA),遇阻即止。尼龙线 插入深度约18 mm,30 min后，抽取栓线对大鼠进行再灌注，缝 合切口后, 用碘酒消毒，动物保温喂养，注意观察造模大鼠生理指征。采用Zea 鼠造模前禁食不禁水24 h,称重后，以10%水合氯醛(0 3longa3评分方法，当造模大鼠清醒后，即评定动物神经功能缺 损。0分：正常。1分：对侧肢体屈曲。2分：拖住尾巴后拉时，对侧 肢体无 力。3分：拖住尾巴后拉时，向对侧转圈。4分：自发向对侧转 圈或倾 倒。5分：无任何自发活动。只有神经功能障碍在1分以上的大鼠才视 为成功模型。实验过程中，共有7只大鼠造模后死亡或不成 功，用备用 的大鼠补充，全部造模成功。1.5实验动

12、物处理正常组：6只，正常给水给食，不予处理。假手术组：18只，大鼠麻醉切 开颈部皮肤后，仅分离CCA, ECA及ICA至PPA,不插线栓。按时相分为24、72、120h 3组，各6只。模型组：18只，栓塞30 min后 再灌注。按时相分为24、72、120h3组，各6只。电针组：18只，栓塞30 min后再灌注。按时相分为24、72、120h3组，各6只。造模成功后进行电针 治疗，参照文献4方法，取大椎、双侧内关穴，用32号0 5寸毫针针刺;大椎与缺血侧（右侧）内关接通G-6805电针治疗仪，采用连续波，频率120次/min,强度1 mA,以局部肌肉轻微抖动为度，每次持续刺激30 min。穴位

13、埋药线组：18只，栓塞30 min后再灌注。按时相分为24、72、120 h3组，各6只。大鼠选取大椎穴、双侧内关穴进行治疗（同电针组）。自制药线长约2mm,其中药物含量约0 2mg。 将药线装入注射针头， 穴位直 刺3mm,轻推针柄将药线埋入，然后将注射针头缓慢退出，埋药处常规消 毒。各治疗组均在缺血再灌注后1 h治疗1次,以后每日治疗1次，分别 治疗1、3 5 d后取材，取材当天不予处理。动物完成观察时间后，各组于各时相，以10%水合氯醛按标准量麻醉大鼠，开胸暴露心脏，将灌注针头从心尖部位插入升主动脉，剪开右心耳,依次迅速灌注20 C的0.9%氯化钠溶液200 mL、4 C的4%多聚甲醛2

14、00 mL（含0,1%DEPC）灌毕迅速取脑，在视交叉平面前后2 mm处将脑冠状切面切开，留取中间部分置于4C的4%多聚甲醛固定液中过 夜。常规上行脱水、透明后用石蜡包埋，连续切片,切片厚5卩 0 每隔10张取1张，使每1张切片上都有海马，然后在60 C左右的 温水中充分 展开，用玻片贴片。每份组织取2张待用。采用免疫组化法（SABC法）。切片经常规脫腊、脱水、3%H2O2灭 活内源性酶、 微波抗原修复， 正常山羊血清封闭， 滴加HSP70单克隆 抗体一抗（1 50）,37C孵育120 mino滴加1滴相应二抗,SABC反应,DAB显色，苏木素不复染。分色、脱水、透明、封片、光学显微镜 下观

15、察各组大鼠病灶侧（右侧），正常组取相对应侧。阴性对照：用正常山羊 血清代替一抗。1 7图像分析在光镜下HSP70蛋白免疫反应阳性细胞为细胞核及细胞浆染成棕黄 色。采用HMIAS-2000高清晰度彩色医学图文分析系统（华中科技 大学 同济医学院千屏影像公司生产）对切片进行图像分析。在40X10倍光镜 视野下，实验各组片海马区域中随机取8个非重叠的视野，测定HSP70免疫阳性细胞平均灰度值并进行分析。平均灰度值在图像分 析中用来表示图像的透光率，分为256级,最黑为0级,最亮为256级，平 均灰度值越高，说明其免疫组化染色越浅，含量越低。1.8统计学方法所有数据以Xis表示，组间比较若满足正态性且

16、方差齐，采用方差分 析和q检验，否则采用H检验和q检验。所有数据均输入计算机，以SPSS11,0软件统计包处理。P V 0.05为差异有统计学意义。2结果（见表1）表1各组大鼠海马HSP70蛋白不同时相平均灰度值（略）注：与正常组比较P V0.01;与假手术组比较，*PV0 01;与模型组比较，探PV0 05,探卩V0.01;与电针组比较,#PV0 05,#PV0,013讨论HSPs是细胞内蛋白的一个家族，热休克（42 C,20 min）、缺血、缺氧、氧自由基、变性蛋白等刺激均能诱导HSPs表达，其中，研究最且生物学意义肯定的是HSP70,且在HSPs家族中含量最为丰富且最保守。正常生理情况下

17、,HSP70基因在脑内无表达或呈低水平表达，各种应表达增加。HSP70是比神经细胞产生病理表现更为敏感的指标。多 项研激情况如热休克或缺血缺氧等刺激可迅速诱导HSP70基因的究表明HSP70的表达减轻了大脑中动脉栓塞模型损伤的程度和 范围2 ,HSP70对脑缺血是一种保护性因素，也是缺血后组织损伤的早期标志，HSP70的存在意味着损伤尚处于可复阶段1 O川茸嗪对急慢性缺血性脑血管病有肯定的治疗效果5。药理研究表明：川茸嗪作为一种钙拮抗剂，可改善脑缺血再灌注后的能量代谢、电生理及线粒体功能，抗自由基的氧化作用，对脑缺血及再灌注后神经 细胞功能有保护作用6。而缓释(植入)剂是一种无菌固体制剂，由药

18、 物和赋型剂籍熔融、热压、辐射等方法制成，具有长效作用和恒释作用7 O药线被植入大椎、双侧内关穴，大椎是督脉上的重要穴位，是手足三阳经与督脉交会穴， 是阳气的集中点或窗口， 可调节诸阳经上传下 达 督脉为阳脉之海，循脊入脑，因此，针刺督脉大椎穴可补益脑髓、醒 脑开 窍、疏通脑络、活血化瘀。心包位于心的外围，针刺心包经的内关可宁心安神定志。有实验表明，电针干预脑缺血再灌注损伤的作用机制与增强HSP70表 达和SOD活性,降低大鼠脑组织中自由基含量有关8。本 实验也表明, 穴位埋药与电针治疗各组能明显上调大鼠缺血侧海马组 织HSP70蛋白表 达,对脑缺血再灌注损伤起保护作用。且穴位埋药作为一种新型的给药途 径，其效果优于电针组(PV0.05)。提示埋药后可 能通过药物的缓慢释 放和对穴位的持续刺激产生长效作用 物和脸穴的双重功效， 故能更好地促进脑缺血再灌注损伤后抗凋亡基 因HSP70蛋白表达，进而有效减少脑缺血再灌注大鼠海马神经细胞 的凋 亡，对脑起到保护作用。缓释剂是近年研究发展的一种新剂型，临床运用有很好的效果9。胶原中药缓释剂穴位埋药，是一种新的剂型和特殊的治疗方法。但因 缓中药缓释剂穴位埋药尚存在许多问题，比如与穴位注射的比较、给药的确切途径、是否进入血脑屏障的药物浓度更高等，都有待于进一步 的研究。【参考文献】1 Kato H, Kogure K. Biochemica