辛伐他丁减少Connexin43表达和兔粥样硬化斑块形成

1、    辛伐他丁减少Connexin43表达和兔粥样硬化斑块形成            作者：时间：2007-11-22 11:27:00                     作者：李建军，林宏，李柱一，李宏增【关键词】  动

2、脉粥样硬化    Simvastatin reduces Connexin43 expression and inhibits rabbit atherosclerotic lesion formation【Abstract】 AIM: To demonstrate that simvastatin can influence atherosclerotic plaque formation and stability by decreasing the expression of gap junction protein connexin43 (Cx43) in

3、 atherosclerotic lesions. METHODS:  The role of Cx43 in atherogenesis was examined by a pharmacological approach. The rabbit model of atherogenesis was established by a highcholesterol diet. The expression of connexin 43 and macrophages in vivo was determined by immunohistochemistry and the exp

4、ression of connexin 43 in cultured smooth muscle cells was determined with Western blot. The quantity of connexin43 expression was analyzed with computer images. RESULTS:  We observed that HMGCoA reductase inhibitors, or "statins", lipidlowering drugs well known for their pleiotropic

5、antiatherogenic effects, reduced Cx43 expression in primary human vascular cells in vitro. Atheroma of rabbits orally treated with simvastatin contained fewer inflammatory cells and exhibited thicker fibrous caps than controls, which was associated with reduced Cx43 expression in lesions of statintr

6、eated rabbits. CONCLUSION:  These data indicate the critical role of Cx43mediated gap junctional communication in atherosclerotic plaque formation. Reduced Cx43mediated intercellular communication leads to changes in atherogenesis. These findings show that Cx43mediated intercellular communicati

7、on can be used as a new potential therapeutic target in atherogenesis.【Keywords】 atherosclerosis; simvastatin; Connexin43【摘要】 目的：证明辛伐他丁可以通过减少缝隙连接蛋白43（Connexin43, Cx43）的表达影响粥样斑块的形成及稳定性. 方法：高脂饲料喂养建立粥样硬化模型，治疗组给予辛伐他丁口服，活体内的Cx43和巨嗜细胞检测使用免疫组织化学方法，培养平滑肌细胞的Cx43检测使用免疫印记方法，Cx43的半定量使用计算机图像处理. 结果：药物干预的培养细胞和模型治疗

8、组中Cx43的表达均明显减少，斑块的组成中，炎症细胞减少50，胶原纤维平滑肌细胞含量增加. 结论： Cx43介导的细胞间通讯在粥样硬化形成中起重要作用，同时辛伐他丁减少Cx43的表达可以增加斑块的稳定性，Cx43成为动脉粥样硬化治疗中一个新的治疗靶点.【关键词】 动脉粥样硬化；辛伐他丁；连接蛋白430引言动脉粥样硬化主要是一种免疫炎症性疾病，它的病理过程是多因素参与的. 包括富含脂质的巨嗜细胞和T淋巴细胞在血管内皮下积聚（脂质条纹）. 由多层的泡沫细胞和增生的平滑肌细胞组成，并伴随有细胞外基质的沉积（粥样斑块）. 在粥样斑块形成过程中的决定性因素是循环中的血液细胞和动脉壁内的细胞之间相互协调的

9、作用1，2.缝隙连接是由许多相关的蛋白家族组成的，叫做Connexins（Cxs）3. 在人体中大约有20多种的Cxs，Cx43是分布最广泛的. Cxs是机能蛋白，半衰期是15 h左右，在生理和病理条件下提供了细胞间相互影响的一种方式4. 细胞间通道的代表缝隙连接在多细胞有机体中通过直接的交换离子和小分子物质提供了一种简单的同步反应的方式5，缝隙连接在慢性的生理过程如细胞的生长发育中起到重要作用. 已经证明在粥样硬化形成中Cx43的表达增加，Cx43在粥样硬化的发病过程中起着重要作用. 我们用实验证明，辛伐他丁可以通过减少Cx43的表达影响粥样斑块形成.1材料和方法兔粥样硬化模型的建立: 3

10、mo龄健康新西兰兔20只,购自第四军医大学实验动物中心，体质量23 kg，适应性喂养1 wk后记录血脂，随机分成两组，每组10只，第一组给予高胆固醇饮食（每100 g饲料含有1 g胆固醇、15 g蛋黄粉，5 g猪油，其余为兔基础饲料）及4 mg/(kgd)淀粉. 第二组除给予高胆固醇饮食外，给予辛伐他丁(湖北丝宝药业) 4 mg/(kgd). 两组均单笼饲养，自由饮水. 12 wk取血，复测血脂.在深麻醉状态下（戊巴比妥钠25 mg/kg，Sigma公司）40 g/L多聚甲醛灌注，取兔主动脉，进行形态学和免疫学分析. 血浆总胆固醇（TC）、三酰甘油（TG）和低密度脂蛋白胆固醇（LDLC）的水平

11、分别采用酶法在日立7170A型生化分析仪上进行测定.1.2.1组织形态学观察及定量分析主动脉被分成两部分，主动脉根部及弓部包埋剂包埋，冰冻切片. 粥样硬化程度的评估采用采用计算机图像分析系统，计算6个相距50 m的切片层面的脂质沉积面积（苏丹染色）占整个血管横截面的比例的平均数.  胸腹段的血管沿着腹中线纵行剖开，苏丹染色，计算病变面积占总胸腹动脉总面积的百分比.1.2.2人血管平滑肌细胞培养采用本院普外科静脉曲张患者手术后切除的大隐静脉，分离培养平滑肌细胞，胎牛血清、DMEM培养基由Gibco公司提供，原代培养采用组织贴块法，培养液为200 g/L胎牛血清加DMEM培养基. 待细胞

12、生长融合出现峰与谷结构后，用含1.25 g/L胰蛋白酶消化液消化、传代培养. 第三代细胞用抗actin肌动蛋白抗体免疫组化法进行鉴定. 于96孔板内接种每孔5000个细胞，加入终浓度为10，2，0.4和0.08 mol/L的辛伐他丁和500 mol/L甲瓦龙酸酯（Sigma）和10 mol/L辛伐他丁，继续培养48 h，培养液为200 g/L胎牛血清加DMEM培养基.1.2.3免疫组化染色主动脉10 m冰冻连续切片，分别加入:抗Cx43一抗1200稀释（武汉博士德公司），二抗及DAB显色采用博士德公司即用型SABC试剂盒SA1022和DAB显色试剂盒AR1022. 操作按照说明书;鼠抗兔CD1

13、4 mAb（标记单核巨嗜细胞）1500稀释（VMRD,Inc）二抗及DAB显色采用博士德公司即用型SABC试剂盒SA1021和DAB显色试剂盒AR1025，操作按照说明书.1.2.4免疫蛋白印记细胞的制备、蛋白定量、电泳（SDSPAGE）、蛋白质转移等操作过程按照文献6进行. 膜片与兔抗Cx43多抗1200稀释（武汉博士德公司）或与兔抗肌动蛋白多抗1200（武汉博士德公司）反应，使用博士德Western Blotting检测试剂盒EK1002，具体操作步骤按照说明书进行，经X线片曝光、显影和定影，显现特异的蛋白信号，利用计算机计算不同区带的信号强弱. 结果的定量化采用Cx43/肌动蛋白信号强弱

14、的百分比.统计学处理： 数据采用x±s表示，主要统计指标均进行正态性检验，两组间的均数比较用两样本t检验，组内不同时间均数比较采用配对t检验. 多组数据组间比较进行方差分析及LSDt检验. 所有统计工作采用SPSS 10.0统计软件进行分析(P<0.05).2结果21各组兔的基本情况辛伐他丁治疗组较对照组12 wk后TC，LDLC分别低56.6%和45.6%（P<0.05）. TG在实验过程中无显著变化(Tab 1).表1对照组和辛伐他丁治疗组兔血脂变化（略）22对粥样斑块损伤面积的影响肉眼观对照组的降主动脉内膜粗糙，有黄白色脂样物质突出管腔，呈弥漫性，远端病变逐渐减轻.

15、 辛伐他丁组粥样硬化病变较对照组减轻. 对两组降主动脉内膜面苏丹染色，斑块被染成红色. 利用计算机图像分析系统计算斑块面积占总面积的百分比. 对照组为（89.1±2.7）%、辛伐他丁组为(55.6±3.8）%，治疗组较对照组    斑块面积减少了38，两组间有显著差异（P<0.05）.23斑块组成成分的对比我们对比了能够反映斑块稳定性的一些指标，例如炎症细胞，血管平滑肌细胞，间质胶原和脂质核心大小等. 对于标本冰冻切片进行Van Gieson氏苦味酸酸性复红染色法染色，粉红色为胶原纤维，黄色为平滑肌细胞，紫黑色为细胞核. 辛伐他

16、丁治疗组拥有明显的纤维帽，其中还混有平滑肌细胞. 拥有较小的脂质核心其中胶原纤维含量明显增加，平滑肌细胞向粥样斑块核心迁移，形成条索状. 对照组纤维帽不明显，脂质核心占整个斑块体积的比例较大，斑块中含有的平滑肌细胞和胶原纤维明显少于治疗组. 平滑肌细胞没有向斑块中迁移（Fig 1A，B），然而单核巨嗜细胞的数量少于对照组，分别为(133±19)和(207±21)个/mm2 (P<0.05). Cx43的表达在治疗组中明显减少（Fig 1C，D）. Cx43的减少同时伴有纤维帽及中层的胶原纤维含量和平滑肌细胞的增加，免疫炎症细胞的减少.24他丁类药物对体外血管平滑肌细胞

17、的Cx43表达的影响利用免疫印记技术证明(Fig  2)，在体外培养的血管平滑肌细胞在辛伐他丁的作用下，减少了Cx43的表达，而且这种减少是剂量依赖性的，由图可见随着辛伐他丁剂量的减少，对于Cx43的表达的减少作用是逐渐减弱的，且用甲瓦龙酸酯可以阻断辛伐他丁减少Cx43表达的作用. 看来本试验中的Cx43的减少确实是由于他丁类药物的作用引起的. 各浓度辛伐他丁组分别与0 mol/L组比较均有明显差异（P<0.05），甲瓦龙酸酯组与10 mol/L组相比有明显的差异性（P<0.05，Fig 2）.3讨论他丁类药物可以降低人类的血浆胆固醇和粥样硬化相关的发病率和死亡率. 许多

18、的体外试验已经证明他丁类药物对于血管细胞的多重作用可以改变粥样硬化的形成和稳定斑块. 这种作用并不是通过降低胆固醇而实现的7.我们可以观察到辛伐他丁通过减少Cx43的表达显著的影响了粥样硬化斑块的形成范围及组成. 其中一个重要的机制可能是减少了白细胞向斑块的渗透. 虽然外周血内的白细胞计数在两组中是相同的，但是，在斑块中对照组的炎症细胞是治疗组的两倍，这提示，内皮细胞和粒细胞间的细胞间通讯可能促进了粒细胞的外渗. Cx43的高表达区与面对血流湍流的粥样硬化易发区域相一致8. 此外，内皮细胞的Cx43的表达已经在粥样斑块的肩部被检测到，同时既往的研究中证明斑块可以扰乱血流，促进粒细胞的黏附和迁移

19、，而多数发生在斑块的肩部9.     治疗组的粥样斑块组成明显的与对照组不同. 脂质核心是斑块的主要的脂质储存所，他丁类治疗组拥有较小的脂质核心和较少的巨嗜细胞. 此外，斑块中包含有更多的平滑肌细胞，同时平滑肌细胞的产物间质胶原纤维也增加. 虽然脂质核心和巨嗜细胞，胶原是人类粥样硬化损伤的特征性改变，但平滑肌细胞的含量与前三者含量相比，对于斑块的稳定性起着更重要的作用10. 因此减少Cx43的表达对于稳定斑块比单纯减小斑块的大小更有意义.免疫蛋白印记证实，辛伐他丁减少Cx43的表达是剂量依赖性的. 随着药物浓度的减低，对于Cx43的抑制作用也减弱. 然而

20、他丁类的这种减少Cx43的作用可以被甲瓦龙酸酯所阻断. 因此可以证明他丁类药物确实可以减少Cx43的表达. 同时也减少了细胞间的通讯11.我们通过利用动物模型和细胞培养两条途径减少Cx43的表达，明显影响了粥样硬化的形成及组成，提供了缝隙连接在粥样斑块形成中起重要作用的新证据. 缝隙连接是识别细胞生长和分化所必须的重要分子结构，在粥样硬化相关细胞间的信号发生改变. 然而现在通过减少Cx43介导的细胞间通讯，究竟如何改变了粥样硬化的形成还不清楚. 最近的研究进展表明，Cx43可以组织特异性的敲除12，可能帮助我们确定哪一种细胞型的Cx43对于粥样硬化是特异的. 无论其机制是什么，我们的试验证明了

21、Cx43介导的细胞间的通讯是一个潜在的粥样硬化治疗靶点.【参考文献】1 Ross R. Atherosclerosis: An inflammatory diseaseJ. N Engl J Med， 1999; 340(2): 115-126.2 Lusis AJ. AtherosclerosisJ. Nature， 2000; 407(6801): 233-241.3 Goodenough DA, Goliger JA, Paul DL. Connexins, connexons, and intercellular communicationJ. Annu Rev Biochem， 19

22、96; 65: 475-502.4 Willecke K, Eiberger J, Degen J, et al. Structural and functional diversity of connexin genes in the mouse and human genomeJ. Biol Chem， 2002; 383(5): 725-737.5 Kumar N, Gilula NB. The gap junction communication channelJ. Cell， 1996; 84: 381-388.6 药立波.医学分子生物学实验技术M.北京：人民卫生出版社，2002:44-52.7 Takemoto M, Liao JK. Pleiotropic effects of 3hydroxy3methylglutaryl coenzymeA reductase inhibitorsJ. Arterioscler Thromb Vasc Biol， 2001; 21(11): 1712-1719.8 Gabriels JE, Paul DL. Connexin43 is highly localized to sites of disturbed flow in r