重组疫苗E.coli LLOOVA经TLR4和NOD1受体诱导树突状细胞表达细胞因子

1、重组疫苗E.coli LLO/OVA经TLR4和NOD1受体诱导树突状细胞表达细胞因子         11-01-30 09:30:00     作者：徐曼, 戴明燊, 米    编辑：studa20【摘要】  目的: 探讨树突状细胞(DC)的模式识别受体(PPRs)活化与细胞因子表达的关系。方法: 采用基因芯片及RTPCR检测经E.coli LLO/OVA刺激后小鼠骨髓树突状细胞（bone marrowderived de

2、ndritic cell, BMDC）的PPRs及其下游NFB信号通路相关分子mRNA的表达水平, 并观察BMDC的活化状况及培养上清液内细胞因子含量。结果: 经E.coli LLO/OVA刺激后2 h, BMDC出现短暂的TLR4 mRNA 表达上调, 其下游信号途径相关的Myd88、 Rip2、 Irak1、 Irak2、 Ikk、 NFB1和NFB2 mRNA均出现表达上调, 黏附分子Icam1、 细胞因子IL1a、 IL1b、 IL6和TNF的mRNA也表达上调; 经E.coli LLO/OVA刺激后4 h, BMDC出现Card4(NOD1) mRNA表达上调, 其下游信号途径相关的

3、Rip2、 Ikk、 NFB1和NFB2 mRNA均出现表达上调, IFN、 TNF和CD40 mRNA也上调表达。经E.coli LLO/OVA刺激后24 h, BMDC表达共刺激分子及MHCII类分子上调; 且培养上清液内IL12和IFN含量增高。结论: 重组疫苗E.coli LLO/OVA经TLR4和NOD1受体激活NFB信号通路, 诱导了小鼠BMDC成熟并表达一系列细胞因子尤其是IL12和IFN。 【关键词】  骨髓树突状细胞; 重组大肠杆菌; 模式识别受体; 基因芯片Abstract  AIM:  To investigate the relations

4、hip between the activation of pattern recognition receptors and the cytokines expression of dendritic cells. METHODS:  After bone marrowderived dendritic cells (BMDCs) were  pulsed by E.coli LLO/OVA,  the mRNA expression of pattern recognition receptors and the downstream NFB signal p

5、athway associated molecules were detected by microarray hybridization and RTPCR;  the expression of costimulatory molecules,  MHC class and cytokines were determined by flow cytometry and ELISA.  RESULTS:  After BMDCs were  pulsed by E.coli LLO/OVA for 2 h,  the levels

6、of TLR4,  Myd88,  Rip2,  Irak1,  Irak2,  Ikk,  NFB1 and NFB2  mRNA upregulated;  and the levels  of Icam1,  IL1a,  IL1b,  IL6 and TNF mRNA upregulated also;  after BMDCs  were pulsed by E.coli LLO/OVA for 4 h,  the levels

7、0; of Card4(Nod1),    Rip2,  Ikk,  NFB1 and NFB2  mRNA upregulated, meanwhile,  the levels  of TNF,  TNF and CD40 mRNA upregulated. The expressions of costimulatory molecules and MHC class of the BMDCs upregulated and the concentration of IL12 and IFN inc

8、reased in the supernatant of BMDCs pulsed by E.coli LLO/OVA at 24 h.  CONCLUSION: Recombinant E.coli LLO/OVA induces   maturation and expression of  cytokines,  especially  IL12 and IFN,  of murine BMDCs through activation of   NFB signal pathway with TLR

9、4 and NOD1 receptors.Keywordsbone marrowderived dendritic cell (BMDC);  recombinant E.coli;  pattern recognition receptors (PPRs);  microarray树突状细胞（dendritic cells,  DC）在诱导和调节机体的获得性免疫和天然免疫中发挥了重要作用, 因此肿瘤疫苗能否有效的活化DC是决定疫苗免疫效果的关键。DC能通过其模式识别受体（pattern recognition receptors,  PPRs

10、）识别病原相关模式分子而活化成熟, 从而诱导天然免疫和调节获得性免疫。Toll样受体（tolllike receptors,  TLR）是最主要的PPR,  目前已发现TLR1TLR13的13个TLR家族成员, 它们多分布于细胞膜, 且每一成员识别特有的模式分子, 如TLR2识别革兰氏阳性菌的糖肽, 而TLR4识别革兰氏阴性菌菌壁的脂多糖（lipopolysaccharide,  LPS）。TLR家族可通过依赖Myd88的信号途径活化NFB介导MHC类分子和共刺激分子表达, 同时也促进炎性细胞因子的分泌, 此外文献还报道TLR4的活化介导了抗肿瘤免疫1, 

11、; 2。近年来研究发现细胞内的PPR核苷酸连接的寡聚化域（nucleotidebinding oligomerization domain,  NOD）受体, 如NOD1和NOD2受体在识别细胞质内的分子后, 也能经NFB信号途径诱导DC产生细胞因子从而启动天然免疫, 并与TLR信号途径协同诱导Th1细胞的产生3,  4。我们采用非致病性大肠杆菌携带模型肿瘤抗原卵白蛋白（ovalbumin,  OVA）和李斯特溶素O（Listeriolysin O,  LLO) 构建的重组疫苗E.coli LLO/OVA体外刺激DC, 用基因芯片杂交和RTPCR等方法检

12、测E.coli LLO/OVA刺激DC TLR和NOD受体及其下游NFB信号途径相关分子活化与细胞因子表达的关系。1  材料和方法1.1  材料  TRIzol RNA提取试剂和琼脂糖购自Invitrogen公司。Rneasy迷你柱购自Qiagen公司。Taq Man逆转录试剂盒购自Roche公司。去内毒素的PBS buffer,  RPMI1640由Cancer research UK提供。重组鼠GMCSF购自Pepritech公司。TrulabelingAMPTM Linear RNA扩增试剂盒、 Oligo GEArray鼠NFB 信号通路基因芯片

13、购自Supperarray公司。PCR引物由Sigma公司合成。FITC连接的抗鼠CD40,  CD80,  CD86 和 IAb(MHCII)荧光抗体购自BD Pharmingen公司。鼠IL12和IFN ELISA试剂盒购自BD Biosciences公司。 68周龄雌性C57BL/6小鼠, 体质量2025 g,  购自英国Harlan公司, 于无菌环境饲养。实验前处死小鼠取其股骨和胫骨骨髓细胞, 培养于RPMI1640培养液（含10 mL/L小牛血清,  重组小鼠GMCSF 6 ng/L）。培养第4天弃去悬浮细胞并更换培养液, 继续培养至第7天,&

14、#160; 收集悬浮的BMDC用于实验。1.2  方法1.2.1  细菌菌株及培养  单克隆含LLO和OVA基因片段质粒的重组E.coli LLO/OVA, 仅含OVA基因片段质粒的重组E.coli OVA经含选择性抗生素的LB液体培养基37摇床培养过夜后, 加入4 mmol/L 的IPTG诱导LLO和OVA的合成, 当培养液A600达到1时收集细菌, 经Western blot验证LLO和/或OVA的表达后, 分装储存于-80备用。E.coli LLO/OVA和E.coli OVA用前均用5 g/L多聚甲醛室温固定30 min, 经去内毒素的PBS 洗3次后,

15、重悬为1012细菌/L, 4冰箱储存备用。1.2.2  BMDC的培养和细菌刺激  将前述的小鼠BMDC（2×109/L）与E.coli LLO/OVA （1011/L）或E.coli OVA(1011/L)按BMDC细菌15的比例混合, 于培养管内用RPMI培养液（加入100 mL/L小牛血清）37, 50 mL/L CO2孵育60 min; 加入庆大霉素50 mg/L杀灭细胞外细菌, 洗涤并重悬细胞于RPMI培养液（加入100 mL/L小牛血清和庆大霉素50 mg/L）继续培养; 分别于2、 4、 6、 8 h后收集细胞用于提取RNA, 24 h后收集细胞及上

16、清用于流式细胞术和ELISA检测。1.2.3  Supperarray探针的合成和杂交  BMDC的总RNA (3 g)经逆转录后, 按Supperarray公司的Oligo GEArray TrulabelingAMPTM Linear RNA扩增试剂盒说明书合成生物素标记的cRNA探针。 6 g的cRNA探针与鼠NFB 信号通路基因芯片在杂交炉内60杂交18 h, 经Buffer I 和Buffer II洗涤后, 加入Solution G于杂交炉内37孵育40 min, 再加入APSA Buffer孵育10 min, CDPStar孵育5 min后取出芯片, 在暗盒内用

17、KODAK胶片覆盖芯片曝光1015 min并冲洗胶片; 扫描仪扫描曝光后的胶片,  所得图片经Superarray 公司GEArray expression 分析软件分析杂交结果。1.2.4  RTPCR  分别将经E.coli LLO/OVA和E.coli OVA刺激后2, 4, 6, 8 h的BMDC提取的2 g总RNA,  用Taq Man逆转录试剂于42,  50 min合成cDNA后, 用PCR 50 L扩增体系扩增Tlr4和Nod1(Card4)的cDNA。RTPCR中所用引物如下: Tlr4(439 bp)F5GGAAGGACTA

18、TGTGATGTGACC3, R 5GCTCTTCTAGACCCATGAAATTGG3; Card4/Nod1 (469 bp) F 5CTTGCATTCAATGGCATCTC3, R 5ACATCGGTGTGCACTGTGGA3; Gapdh (496 bp) F 5TGATGGGTGTGAACCACGAG3, R 5TCAGTGTAGCCCAAGATGCC3。反应体系扩增条件如下: 于94变性5 min后, 94变性45 s、 55复性45 s、 72延伸45 s共30个循环, 最后72再延伸10 min。于12 g/L琼脂糖凝胶电泳检测扩增条带。1.2.5  细胞因子检测

19、60; 按试剂盒操作说明向测定板孔内分别加入50 L IL12或 IFN标准、 控制液和BMDC培养上清液, 于室温孵育2 h并用Buffer洗涤5次后, 加入100 L连接反应液于室温孵育2 h并洗涤5次后, 加入显色反应液室温避光孵育30 min; 终止反应后在酶标仪上测定A450值。1.2.6  细胞表面分子检测  分别收集E.coli LLO/OVA或E.coli OVA刺激24 h后的BMDC, 将细胞密度调整为1×105细胞/80 L , 分别加入FITC连接的抗CD40、  CD80、 CD86和MHCII (IAb)抗体, 4避光孵育30

20、 min; FACS Buffer 洗3次后重悬细胞进行流式细胞术检测。1.2.7  统计学分析  采用SAS8.0 软件students  t test进行统计学分析,  P<0.05具有统计学意义。2  结果2.1  重组疫苗E.coli LLO/OVA经TLR4和Card4（NOD1）活化BMDC  小鼠NFB基因芯片杂交结果显示经E.coli LLO/OVA刺激后2 h,  BMDC出现短暂的TLR4 mRNA表达上调, 其下游信号途径相关的Myd88、 Rip2、 Irak1、 Irak2、 Ikk

21、、 NFB1和NFB2 mRNA均出现表达上调, 黏附分子Icam1、 细胞因子IL1a、 IL1b、 IL6和TNF的mRNA也出现表达上调; 经E.coli LLO/OVA刺激后4 h, BMDC出现Card4（NOD1）mRNA及其下游信号途径相关的Rip2、 Ikk、 Ikk、 NFB1和NFB2 mRNA表达上调, 同时IFN、 Lta(TNF)和TNFsf5(CD40) mRNA也表达上调（图1）。    RTPCR结果也证实BMDC在受E.coli LLO/OVA刺激后2 h出现TLR4 mRNA表达上调, 且表达水平略高于E.coli OVA刺激的

22、BMDC; BMDC经E.coli LLO/OVA刺激后48 h NOD1(Card4)mRNA持续表达上调, 而BMDC 仅在被E.coli OVA刺激6 h后出现Nod1(Card4)mRNA表达上调（图2）。图1  BMDC经E.coli LLO/OVA刺激后的基因表达（略）Fig 1  The mRNA expression of murine BMDC pulsed by E.coli LLO/OVA2.2  BMDC上调表达共刺激分子和MHCII类分子  在E.coliLLO/OVA刺激后24 h,  BMDC上调表达共刺激分子CD40、 CD