生物化学实验知识点整理(南林大)――xiao_白123

1、生物化学实验知识点整理第一次实验(实验一、实验四 实验一 还原糖的测定1. 实验是定性实验还是定量实验? 定量实验 2. 还原糖测定的原理总糖具有还原性,在测定条件下,能水解为还原性单糖。还原糖由于分子中含有游离的 醛基(-CHO 或酮基(>C=O ,故具有还原性。3,5-二硝基水杨酸与还原糖溶液共热后被还原成棕色的氨基化合物 , 在 550nm 处测定光 的吸收增加量,得出该溶液的浓度,从而计算得到还原糖的含量。 3. 实验反应式:4. 多糖水解方法:酸水解、碱水解。 5. 怎样检验淀粉都已经水解?加入 1-2滴碘液,如果立即变蓝则说明没有完全水解,反之,则说明已经完全水解。 6. 测

2、定总糖的化学方法:水杨酸比色法、斐林氏法、高锰酸钾法、铁氰化钾法。本实验采用水杨酸比色法,是一种半微量定糖法。操作简便、快速、杂质干扰较少。但待 测溶液要求澄清,比色时糖溶液浓度要在一定范围内。实验二 粮食中总糖含量的测定 1. 总糖测定原理 多糖为非还原糖, 可用酸将多糖和寡糖水解成具有还原性的单糖, 在利用还原糖的性质进 行测定,便可分别求出总糖和还原糖的含量 2. 本实验使用的是电子天平。 3. 用沸水冷凝回流的作用:(1盐酸会挥发,使 HCl 冷凝回流至锥形瓶中,防止 HCl 挥发,从而降低 HCl 的浓度。 (2保持水分。4.20%NaOH用量:因为 1:1反应,所以 HCl NaO

3、H n n = 。由 6mol/L x 0.030L Hcl =20%NaOH x V/40 算得: V=36mL 滴加方式 先加 35mL 再逐滴 直接加 36mL 中和。5. 不能中途换分光光度计 , 因为不同的分光光度计的光源发光强度不同。 6. 分光光度计的原理:在通常情况下,原子处于基态,当通过基态原子的某辐射线所具有的能量(或频率 恰好符合该原子从基态跃迁到激发态所需的能量 (或频率 时, 该基态原子就会从入射辐 射中吸收能量, 产生原子吸收光谱。 原子的能级是量子化的, 所以原子对不同频率辐射的 吸收也是有选择的。这种选择吸收的定量关系服从式 /E h hc =。实验证明,在一定

4、浓度范围内,物质的吸光度 A 与吸光样品的浓度 c 及厚度 L 的乘积 成正比,这就是光的吸收定律,也称为郎伯 -比尔定律 分光光度计就是以郎伯比尔定律为原理,来测定浓度 7. 为什么要水解多糖才能用 DNS ?因为 DNS 只能与还原糖溶液在加热的条件下反应生成棕红色的氨基化合物,不能与没有 还原性的多糖反应。8. 计算公式中为什么要乘以 0.9? 第二次实验(实验十、实验十五实验十 蛋白质的水解和纸色谱法分离氨基酸1. 纸色谱分离氨基酸分离原理由于各氨基酸在固定相(水和流动相(有机溶剂中的分配系数不同,从而移动速度 不同,经过一段时间后,不同的氨基酸将存在于不同的部位,达到分离的目的。2.

5、 天然氨基酸一般情况下为 L 型,甘氨酸无旋光性。3. 蛋白质水解:蛋白质可被酸、碱、酶水解成其最终产物氨基酸。酸式水解的优点是:是保持氨基酸的旋光性不变,原来是 L 型, 水解后还是 L 型,由于甘 氨酸所有的 R 基团是氢原子,所以它不是 L 型。大多数氨基酸在煮沸酸中是稳定的, 但是色氨酸完全被破坏。 色氨酸水解产物为棕黑色物 质腐黑质。5. 酵母粉水解后绝对不含有色氨酸。6. 根据分离原理不同分离色谱可分为:有吸附色谱、离子交换色谱、分配色谱等7. 不同物质的 R f 值不同,同种物质不同条件的 R f 值也不同。故要保持统一操作环境。8. 喷完茚三酮后不能直接放入烘箱,需先自然晾干再

6、放入烘箱内。因为茚三酮乙醇高温易着火, 烘箱的金属条过热也会显色。 容易出现拖尾或斑点状, 样 品显色后成条状, ;酵母分解后不知有 5个斑点,会有很多种,两种之间可能还有其它的氨 基酸,9. 茚三酮的反应方程式实验十五 考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度1. 原理:在一定的浓度范围里,考马斯亮蓝 G250蛋白质复合物呈色后,在 595nm 下,吸光 度和蛋白质含量呈线性关系。2. 考马斯亮蓝分为 G-250(反应速度快,不易洗脱,用定量测定 、 R-250反应速度慢,易洗 脱,通常用于定性测定。3. 蛋白质与考马斯亮蓝 G-250反应十分迅速,在 2min 左右反应达平衡,结合物在室温下, 1h 内

7、保持稳定。4. 盐析:指溶液中加入无机盐类而使某种物质溶解度降低而析出的过程。 (是可逆过程 蛋白质的盐析:蛋白质中加入某些饱和盐,蛋白质溶液中浓度下降,蛋白质析出。5. 实验中需加 19g 硫酸铵。实验十一 血清蛋白的醋酸纤维薄膜电泳 1. 醋酸纤维薄膜电泳的原理血清中各种蛋白质离子在电场的作用下,向着与其电性相反的电极移动。由于各种蛋白 质的等电点不同, 从而在同一 pH 环境中所带电荷量有所不同, 同时分子大小形状各有差异, 所以在统一电场中泳动速度不同。一般来说, 所带的电荷多且颗粒小的,泳动速度快, 反之 则慢。2. 影响电泳的因素:(1带电粒子本身 (电荷量、粒子大小、形状(2溶解

8、液性质(PH 、离子强度、粘度、电场强度、温度、电渗透、支持物筛孔 3. 醋酸纤维薄膜的优点具有均一的泡沫样结构,厚度仅 120微米, 有强渗透性,对分子移动无阻力,作为区带电 泳的支持物进行蛋白质电泳有简便、快速、样品用量少,应用范围广,分离清晰,没有吸附 现象等。4.pH8.6的缓冲液中血清蛋白带负电,向阳极泳动。5. 五条带的顺序:血清蛋白、 1球蛋白、 2球蛋白、 球蛋白、 球蛋白6. 实验时,在粗糙面点样,在光滑面做记号。浸泡时,粗糙面朝上,电泳时粗糙面朝下。 7. 实验成败的关键:(1醋酸纤维薄膜的处理 (2缓冲液的选择 (3加样量 (4电流的选择 (5染色液的选择 (6透明与保存

9、实验二十三 维生素 C 的定量测定1. 原理:维生素 C 具有很强的还原性,根据其还原性可测定其含量。还原型抗坏血酸能还原 2, 6-二氯酚靛酚染料, 本身则氧化为脱氢型。 在酸性溶液中, 2, 6-二氯酚靛酚呈红色,还原后变为无色。 因此,当染料滴定含有维生素 C 的酸性溶液时,维 生素 C 尚未全部被氧化前, 则滴下的染料立即变成无色。 一旦溶液中的维生素 C 全部被氧化, 则滴下的染料立即使溶液变成粉红色,即为滴定终点。 2.1%草酸有何作用(1提供一个显色环境 (2提供一个酸环境 (3保护维生素 C (4作空白对照 3. 提取时,为什么加 2%草酸?(步骤 1加入后配成 1%草酸 4.

10、 维生素 C 含量:猕猴桃 >青椒 >苹果 梨子实验十四 蛋白质总氮含量的测定1. 凯氏定氮法的原理:含氮有机化合物在浓硫酸中消化生成硫酸铵,再在凯氏定氮仪中加入强碱碱化消化液使 硫酸铵分解放出氨气。 用水蒸气蒸馏法将氨蒸入过量标准无机酸溶液中, 然后用标准酸溶液 进行滴定,准确测定按量,从而计算出含氮量。其中, CuSO4为催化剂, K2SO 或 NaSO4可提高消化液的沸点。2. 用此方法通常会高于实际含量的原因?因为测量的是被测物中氮的总含量, 其来源不仅是蛋白质的含氮量, 还有其他杂质的含氮 量,所以会偏高。3.H3BO3指示剂:在 pH<5.4时为紫红(5.2 ;

11、pH>5.4时为绿色(5.6 ; pH=5.4时,为暗蓝 色或灰色。变色点为 5.4。指示剂变色的范围很窄,极其灵敏。4. 本实验四步骤:消化、洗涤、蒸馏、滴定5. 凯氏定氮法与考马斯亮蓝法对比:在时间上,凯氏需反应 2小时以上,而考马斯只需反应 2min凯氏定氮法可测任意形态蛋白质,而考马斯亮蓝法只能测可溶性蛋白质凯氏定氮法反应迟缓,考马斯亮蓝法比较灵敏、反应迅速。6. 怎样检测蒸馏器已洗净?将装有 5ml 硼酸指示剂混合液锥形瓶放于冷凝器下方, 并将冷凝器下方导管下端插入锥形 瓶液面下,蒸馏 1 2分钟,如果锥形瓶液体不变绿色,表明洗净,否则再洗。7. 为什么小漏斗内要作保留一点 30%NaOH?因为 NaOH 加入后会立即反应放出氨气,保留一点 30%NaOH主要作水封,防止氨气溢出。实验二十七 正交法测定几种因素对酶活性的影响1. 原理:利用正交表来安排多因素实验。 由试验因素的全部水平组合中, 挑选部分有代表性 的水平组合进行试验, 通过对这部分试验的