干酪乳杆菌LC_STH_13高密度培养基优化

1、干酪乳杆菌LC-STH-13高密度培养基优化孙天昊,*梁金钟(哈尔滨商业大学食品工程学院,黑龙江哈尔滨150076摘要:以干酪乳杆菌LC-STH-13为菌种,使用M RS 基础培养基对菌种的进行活化。根据M RS 培养基中的不同体系,对其进行改良,获得改良的M RS 培养基。改良M RS 培养基配方为:大豆蛋白胨9g ,牛肉粉11g ,酵母浸粉5.2g ,乳糖19g ,磷酸氢二钾2.2g ,柠檬酸三钠1.8g ,柠檬酸铵2.4g ,吐温801mL ,M gSO 4·7H 2O 0.56g ,M nSO 4·4H 2O 0.25g 。使用改良M RS 培养基培养的菌体活菌数比

2、M RS 高出了1个数量级;在OD 值和菌体干质量指标上,改良M RS 是M RS 的1.2倍。Optimization of High-density Culture Medium of Lactobacillus CaseiLC-STH-13StrainSun Tianhao,*Liang Jinzhong(Food Engineering College,Harbin University of Commerce,Harbin,Heilongjiang 150076,ChinaAbstract:Lactobacillus Casei LC-STH-13strain is used,and

3、 M RS medium is used to separate and purify the strain.According to the different systems of M RS medium,improving it to get a modified M RS medium.The ingredients of the modified M RS are that soy peptone 9g,beef powder 11g,yeast extract powder 5.2g,lactose 19g,dipotassium hydrogen phosphate 2.2g,t

4、risodium citrate 1.8g,ammonium citrate 2.4g,tween 801mL,M gSO 4·7H 2O 0.56g,M nSO 4·4H 2O 0.25g.The viable count of Lactobacillus Casei with modified M RS are ten times than those with M RS.Also,between OD value and dried weight,the modified M RS medium is nearly 1.2times than the basis M

5、RS medium.Key words:Lactobacillus Casei;M RS medium;OD value;high-density culture收稿日期:2010-10-12作者简介:孙天昊(1983-,男,黑龙江人,在读硕士,研究方向:微生物发酵技术。*为通讯作者:梁金钟(1957-,男,教授,研究方向:微生物。0引言干酪乳杆菌(Lactobacillus casei,属于乳杆菌属(Lactobacillus,呈革兰氏阳性,不产芽抱,无鞭毛,不运动,兼性异型发酵乳糖,不液化明胶,接触酶阴性;最适生长温度为37;菌体长短不一,两端方形,常成链,菌落粗糙,灰白色,有时呈微黄色;

6、生化反应能发酵多种糖1。干酪乳杆菌具有高效降血压降胆固醇,并且能够诱导产生抗菌素,促进细胞分裂,产生抗体免疫,增强人体免疫及预防癌症和抑制肿瘤生长等作用2。人体通过正常食物摄入的途径,获得干酪乳杆菌对人体有益的作用,就需要满足乳杆菌必须具有抵抗胃酸、胆汁、胰酶等的能力,才能在肠道成功黏附,最终达到效果。可以说,益生菌产品中高浓度的活性菌体细胞是发挥功效的必要条件。因此,实现益生菌高密度培养,是近几年益生菌研究领域的重要目标和方向之一3。1材料与方法(1菌种来源。干酪乳杆菌(Lactobacillus Casei LC-STH-13,哈尔滨商业大学发酵工程实验室保藏菌种。(2试验材料。M RS

7、培养基和改良M RS 培养基过程中使用的药品,均为分析纯。采用M RS 培养基作为基础培养基,通过单因素试验,对培养基各成分进行优化。M RS 基础培养基配方为:蛋白胨10g ,牛肉粉10g ,酵母浸粉5g ,葡萄糖20g ,无水乙酸钠2g ,柠檬酸铵2g ,磷酸第12期(总第229期农产品加工·学刊No.122010年12月Academic Periodical of Farm Products Processing Dec.文章编号:1671-9646(201012-0042-062010年第12期氢二钾2g,吐温801mL,MgSO4·7H2O0.58g, M nSO

8、4·4H2O0.25g,水1000mL,调pH值至6.26.4,在121下灭菌15min4。根据培养基的成分可以划分为以下5种类型。(1碳源:葡萄糖。(2氮源:蛋白胨、牛肉粉、酵母浸粉。(3缓冲盐:无水乙酸钠、柠檬酸铵、磷酸氢二钾。(4微量元素:MgSO4·7H2O,MnSO4·4H2O。(5表面活性剂:吐温80。根据M RS基础培养基,分别对碳源,氮源,缓冲盐和微量元素4个体系做单因素试验,按质量分数5%的接种量接种发酵,测定菌体的OD值,以确定各个体系的最佳成分。缓冲溶液正交试验因素与水平设计见表1,微量元素正交试验因素与水平设计见表2。1.2.3改良MR S

9、培养基与MR S培养基对比试验在确定了改良MRS培养基的配方后,将改良M RS与M RS通过OD值,对活菌数和菌体干质量指标进行对比,评价改良MRS培养基的改良效果。OD值:菌体培养24h,将菌液稀释5倍。在波长600nm下,使用紫外分光光度计测定菌体的OD 值,每次做3个平行试验,取平均值。活菌计数法:采用稀释平板计数法,将菌液10倍递增稀释到合适的浓度后,用MRS固体培养基倾注平板,培养48h,菌落计数5。干质量法:分别配置100mL的M RS和改良M RS液体培养基,5%的接种量,培养24h。在转速8000r/min下离心20min,弃上清液,放入80烘箱干燥至恒质量。称质量,减去离心管

10、质量,求出菌体的干质量。2结果与讨论2.1改良型M RS培养基成分的确定以MRS基础培养基为基准,不改变其他系统的成分和用量,只改变碳源的成分,用果糖等糖类代替葡萄糖。接种量为5%,培养24h,测定菌体的OD值。碳源单因素试验见图1。从图1可知,干酪乳杆菌利用糊精和蔗糖的效果不太理想,葡萄糖和果糖的利用差不多,因为二者都是单糖。但是,乳糖的OD值是最高的,虽然乳糖是双糖,但是它可水解为葡萄糖和半乳糖,这2种单糖都是干酪乳杆菌可以利用的。因此,选择乳糖代替葡萄糖为碳源。以MRS基础培养基为基准,不改变其他系统的成分和用量,只改变氮源中蛋白胨的成分,以大豆蛋白胨等蛋白胨类产品代替蛋白胨。接种量为5

11、%,培养24h,测定菌体的OD值。氮源单因素试验见图2。从图2可知,酪蛋白胨、胰蛋白胨和蛋白胨的OD值都在1附近,干酪乳杆菌利用它们的效果基本差不多。但大豆蛋白胨的OD值接近1.2,因为大豆蛋白胨里含丰富的氨基酸和生长因子,利于干酪乳杆菌生长的成分,所以在蛋白胨这部分,用大豆蛋白胨代替蛋白胨。缓冲盐体系中的阴离子能中和乳酸菌发酵产生的乳酸,用以调节发酵液的pH值。它的阳离子还能起到平衡渗透压的作用。因此,分别从阳离子和阴离子两方面,做缓冲盐的单因素试验。阳离子要具有钾离水平A磷酸氢二钾B柠檬酸三钠C柠檬酸铵1 2 3表1缓冲溶液正交试验因素与水平设计/g·L-1水平A MgSO4&#

12、183;7H2O B M nSO4·4H2O123表2微量元素正交试验因素与水平设计/g·L-1图1碳源单因素试验果糖OD值碳源葡萄糖蔗糖麦芽糖乳糖糊精图2氮源单因素试验大豆蛋白胨OD值碳源酪蛋白胨胰蛋白胨蛋白胨孙天昊,等:干酪乳杆菌LC-STH-13高密度培养基优化·43·农产品加工·学刊2010年第12期a 1b 1c 1O D 值a 1b 2c 1a 1b 3c 1a 2b 1c 1a 2b 2c 1a 2b 3c 1a 3b 1c 1a 3b 2c 1a 3b 3c 1MRS子、钠离子和铵根离子;阴离子要具有磷酸根离子、柠檬酸根离子和乙

13、酸根离子。(1按阳离子分类单因素试验。为了满足阳离子具有钾离子、钠离子和铵根离子的要求,每种阳离子选1种缓冲盐,保证体系内有3种缓冲盐。缓冲盐代替MRS 缓冲体系进行单因素实验,不改变其他系统的成分和应用。接种量为5%,培养24h ,测定菌体的OD 值。阳离子单因素试验和各平均值见表3,缓冲溶液单因素试验A 见图3。由图3可知,磷酸氢二钾的效果比磷酸二氢钾好,柠檬酸铵比柠檬酸氢二铵好,因为酸根离子价越高,中和酸的能力越强,可见,发酵液pH 值的升高,有利于菌体的生长。从各缓冲盐的平均值来看,a 2b 1c 2组合(即M RS 的平均OD 值最高。但是在单因素试验中,a 2b 3c 2的组合OD

14、 值最高,达到1.241。其原因也是柠檬酸根式负三价,而乙酸根是负一价,前者升高pH 能力比后者强,所以选择“磷酸氢二钾、柠檬酸三钠、柠檬酸铵”的缓冲体系。由柠檬酸三钠代替无水乙酸钠。(2按阴离子分类单因素实验。为了满足阴离子具有磷酸根离子、柠檬酸根离子和乙酸根离子的要求,每种阴离子选1种缓冲盐,保证体系内有3种缓冲盐。缓冲盐代替MRS 缓冲体系进行单因素试验,不改变其他系统的成分和应用。接种量为5%,培养24h ,测定菌体的OD 值。表3阳离子单因素试验和各平均值水平1234铵根离子柠檬酸氢二铵柠檬酸钠平均值钾离子磷酸二氢钾磷酸氢二钾平均值乙酸钠磷酸氢二钠柠檬酸三钠酒石酸钾钠平均值图3缓冲溶

15、液单因素试验A阴离子单因素试验和各平均值见表4,缓冲溶液单因素试验B 见图4。由图4和表4可知,a 2b 2c 1组合OD 值无论是缓冲盐的平均值,还是单因素试验都是最高的,且高于对照的MRS ,所以选择“磷酸氢二钾、柠檬酸三钠、乙酸钠”的缓冲体系。综合上述2个试验中,阳离子实验最大OD 值1.241,阴离子实验最大OD 值1.179。其原因可能就在于柠檬酸根中和酸的能力大于乙酸根。所以最后选定“磷酸氢二钾、柠檬酸三钠、柠檬酸铵”的组合。表4阴离子单因素试验和各平均值水平123c 乙酸根离子乙酸钠a 磷酸根离子磷酸二氢钾磷酸氢二钾酒石酸钾钠平均值0.9611.1250.975b 柠檬酸根离子柠

16、檬酸氢二铵柠檬酸三钠柠檬酸铵平均值这样能最大限度中和乳酸,调节pH 值,提高干酪乳杆菌的生长量。分别选取硫酸亚铁等硫酸盐以0.058g/L 的质量浓度作培养基的微量元素,以1瓶不添加任何微量元素作对照组。接种量为5%,培养24h ,测定菌体的OD 值。微量元素单因素试验见图5。1.41.21.00.80.60.40.20.0a 1b 1c 1O D 值a 1b 1c 2a 1b 2c 2a 1b 3c 1a 1b 3c 2a 1b 4c 1a 1b 4c 2a 2b 1c 1a 2b 1c 2a 2b 2c 1a 2b 2c 2a 2b 3c 1a 2b 3c 2a 2b 4c 1a 2b 4

17、c 2a 1b 2c 1·44·2010年第12期由图5显示,硫酸铜的OD 值很低,说明Cu 2+对干酪乳杆菌的生长起抑制作用。硫酸镁和硫酸锰的OD 值最高,明显高于未加任何微量元素的对照组。所以微量元素中还继续使用M RS 中的这2种成分。经过了一系列单因素替换试验,确定了改良M RS 的基本配方:碳源为乳糖;氮源为大豆蛋白胨、酵母浸粉、牛肉粉;缓冲溶液为磷酸氢二钾、柠檬酸三钠、柠檬酸铵;微量元素为M gSO 4·7H 2O ,M nSO 4·4H 2O ;表面活性剂为吐温80。2.2改良型M RS 培养基成分使用量的确定2.2.1碳源(乳糖使用量的确

18、定不改变培养基其他成分,根据M RS 中葡萄糖的质量浓度1822g/L ,测定乳糖的使用量。接种量为5%,培养24h ,测定菌体的OD 值。乳糖使用量测定见图6。(1大豆蛋白胨使用量的确定。不改变培养基其他成分,根据M RS 中蛋白胨的质量浓度812g/L ,测定大豆蛋白胨的使用量,接种量为5%,培养24h ,测定菌体的OD 值。大豆蛋白胨使用量测定见图7。由图7可知,大豆蛋白胨质量浓度为9g/L 时,菌体OD 值最高,达到了1.107。增加大豆蛋白胨的浓度菌体的生长量也没有增大,可能与培养基其他成分用量有关。因此大豆蛋白胨的使用量确定为9g/L 。(2酵母浸粉使用量的确定。不改变培养基其他成

19、分,根据M RS 中酵母浸粉的质量浓度4.65.4g/L ,测定酵母浸粉的使用量。接种量为5%,培养24h ,测定菌体的OD 值。酵母浸粉使用量测定见图8。由图8可知,酵母浸粉质量浓度为5.2g/L 时,菌体OD 值最高,达到1.282。故酵母浸粉的使用量确定为5.2g/L 。(3牛肉粉使用量的确定。不改变培养基其他成分,根据M RS 中牛肉粉质量浓度812g/L ,测定牛肉粉的使用量,接种量为5%,培养24h ,测定菌体的OD 值。牛肉粉使用量测定见图9。由图9可知,当牛肉粉质量浓度为11g/L 时,菌体OD 值最高,达到1.156。故牛肉粉的使用量确定为11g/L 。(1磷酸氢二钾使用量的

20、确定。不改变培养基其他成分,根据MRS 中磷酸氢二钾的质量浓度图6乳糖使用量测定图5微量元素单因素试验硫酸亚铁O D 值硫酸铜硫酸锰硫酸锌硫酸镁对照组1819202122O D 值乳糖质量浓度/g ·L -1图7大豆蛋白胨使用量测定089101112O D 值大豆蛋白胨质量浓度/g ·L -1图8酵母浸粉使用量测定O D 值酵母浸粉质量浓度/g ·L -1图9牛肉粉使用量测定89101112O D 值牛肉粉质量浓度/g ·L -1孙天昊,等:干酪乳杆菌LC-STH-13高密度培养基优化·45·农产品加工·学刊2010年第12

21、期1.62.4g/L ,测定磷酸氢二钾的使用量,接种量为5%,培养24h ,测定菌体的OD 值。磷酸氢二钾使用量测定见图10。由图10可知,质量浓度为2.0g/L 时,菌体OD值最高,达到1.16。之后增大了磷酸氢二钾的用量,菌体的OD 值下降很明显,可能是阳离子量的增多,增大了渗透眼,抑制了菌体的生长。因此磷酸氢二钾的使用量确定为2.0g/L 。(2柠檬酸三钠使用量的确定。不改变培养基其他成分,根据MRS 中乙酸钠的质量浓度1.62.4g/L ,测定柠檬酸三钠的使用量,接种量为5%,培养24h ,测定菌体的OD 值。柠檬酸三钠使用量测定见图11。时,菌体OD 值最高,达到1.164。之后随着

22、柠檬酸三钠浓度的增大,菌体OD 值明显下降,可能是钠离子增大了菌液的渗透压,抑制了菌体的生长。因此柠檬酸三钠的使用量确定为1.8g/L 。(3柠檬酸铵使用量的确定。不改变培养基其他成分,根据M RS 中柠檬酸铵的质量浓度1.62.4g/L ,测定柠檬酸铵的使用量,接种量为5%,培养24h ,测定菌体的OD 值。柠檬酸铵的使用量测定见图12。(1MgSO 4·7H 2O 使用量的确定。不改变培养基其他成分,根据MRS 中微量元素硫酸镁的质量浓度0.540.62g/L ,测定硫酸镁的使用量,接种量为5%,培养24h ,测定菌体的OD 值。硫酸镁的使用量测定见图13。由图13显示,硫酸镁质

23、量浓度为0.56g/L 时,菌体OD 值最高,达到1.26。之后,随着硫酸镁浓度的增大,菌体OD 值显著下降,因为微量元素的浓度增大会抑制菌体的生长。因此硫酸镁的使用量确定为0.56g/L 。(2MnSO 4·4H 2O 使用量的确定。不改变培养基其他成分,根据MRS 中微量元素硫酸锰的质量浓度0.210.29g/L ,测定硫酸锰的使用量,接种量为5%,培养24h ,测定菌体的OD 值。硫酸锰使用量测定见图14。由图14显示,硫酸锰质量浓度为0.25g/L 时,菌体OD 值最高,达到1.227。开始时,硫酸锰的浓度增大,菌体OD 值增大;达到最大值后,菌体的图10磷酸氢二钾使用量测定

24、O D 值磷酸氢二钾质量浓度/g ·L -1图11柠檬酸三钠使用量测定O D 值柠檬酸三钠质量浓度/g ·L -1图12柠檬酸铵的使用量测定O D 值柠檬酸铵质量浓度/g ·L -1图13硫酸镁的使用量测定O D 值硫酸镁质量浓度/g ·L -1图14硫酸锰使用量测定O D 值硫酸锰质量浓度/g ·L -1·46·2010 年第 12 期 孙天昊，等：干酪乳杆菌 LC- STH- 13 高密度培养基优化 · · 47 OD 值显著下降，因为微量元素浓度过大会抑制菌体 的生长。因此硫酸锰的使用量确定为 0.

25、25 g/L。 2.3 改良 MRS 培养基优化正交试验 2.3.1 缓冲溶液正交试验 缓冲溶液正交试验结果与分析见表 5。 表5 试验号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 k1 k2 k3 R 1 1 1 2 2 2 3 3 3 0.976 1.029 1.046 0.07 追加试验结果见表 7。 表7 组号 A1B2 A2B2 追加试验结果 活菌数 /cfu mL- 1 · 1.7×1010 3.6×1010 缓冲溶液正交试验结果与分析 B 柠檬酸三钠 C 柠檬酸铵 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1.02 1.038 0.994 0.044 1 2 3

26、 2 3 1 3 1 2 0.964 1.035 1.053 0.089 OD 值 0.913 1.038 0.978 1.039 1.073 0.976 1.108 1.002 1.027 A 磷酸氢二钾 根据表 7 追加试验结果可知，最优组合为 A2B2。 2.4 改良 MRS 培养基对比试验 通过单因素、正交试验的一系列优化，确定了改 良 MRS 培养基的组成和用量。具体配方如下：大豆 蛋 白 胨 9 g， 牛 肉 粉 11 g， 酵 母 浸 粉 5.2 g， 乳 糖 19 g，磷酸氢二钾 2.2 g，柠檬酸三钠 1.8 g， 柠檬酸 铵 2.4 g， 吐 温 80 1 mL， MgSO

27、4 · 2O 0.56 g， 7H MnSO4 4H2O 0.25 g，水 1 L。 · 对比试验结果见表 8。 表8 项目 MRS 改良 MRS OD 值 1.143 1.395 对比试验结果 活菌数 /cfu mL- 1 · 1.17×1012 2.39×1013 菌体干质量 /g (100 mL - 1 · ） 0.998 8 1.177 2 正交试验表明，3 种缓冲盐中柠檬酸铵对菌体 OD 值得影响最大，影响依次是：柠檬酸铵 > 磷酸氢 二钾 > 柠檬酸三钠。最优组合为 A3B2C3，由于上述 9 个试验中并没有此最优组合，因此还需要追加试验确 定最优组合的 OD 值，最优组合和正交试验的最大值 A3B1C3 进行比较。最优组合 A3B2C3 的 OD 值经测定为 1.129，大于 A3B1C3，符合试验结果。因此，可以确 定缓冲盐体系的最佳组合为 A3B2C3。 2.3.2 微量元素正交试验 微量元素正交试验结果与分析见表 6。 表6 试验号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 k1