微生物实验指导书11

1、 微生物学实验 实验指导书 广东工业大学环境科学与工程学院实验一 显微镜的使用、细菌革兰氏染色法及细菌特殊结构的观察（一） 实验目的1. 了解普通光学显微镜的基本构造和工作原理2. 学习并掌握油镜的原理和使用方法。 3. 在油镜下观察细菌几种基本形态4掌握细菌革兰氏染色法（二） 实验原理1显微镜的基本结构及油镜的工作原理      现代普通光学显微镜利用目镜和物镜两组透镜系统来放大成像，故又常 被称为复式显微镜。它们由机械装置和光学系统两大部分组成。在显微镜的光学系统中，物镜的性能最为关键，它直接影响着显微镜的分辨率。而在普通光学显微

2、镜通常配置的几种物镜中，油镜的放大倍数最大，对微生物学研究最为重要。与其他物镜相比，油镜的使用比较特殊，需在载玻片与镜头之间加滴镜油，这主要有如下二方面的原因：     1. 增加照明亮度     油镜的放大倍数可达 100 ，放大倍数这样大的镜头，焦距很短，直径很小，但所需要的光照强度却最大。从承载标本的玻片透过来的光线，因介质密度不同（从玻片进入空气，再进入镜头），有些光线会因折射或全反射，不能进入镜头，致使在使用油镜时会因射入的光线较少，物像显现不清。所以为了不使通过的光线有所损失，在使用油镜时须在油镜与玻片

3、之间加入与玻璃的折射率（ n=1.55 ）相仿的油镜（通常用香柏油，其折射率 n=1.52）。     2. 增加显微镜的分辨率 显微镜的分辨率或分辨力 (resolution or resolving power) 是指显微镜能辨别两点之间的最小距离的能力。从物理学角度看，光学显微镜的分辨率受光的干涉现象及所用物镜性能的限制，分辨力D可表示为：D=/2N.A，式中= 光波波长； NA= 物镜的数值孔径值。    光学显微镜的光源不可能超出可见光的波长范围（ 0.4-0.7 m ），而数值孔径值则取决于物镜的镜口角和玻片与镜

4、头间介质的折射率，可表示为：NA=n × sin 式中为光线最大入射角的半数。它取决于物镜的直径和焦距，一般来说在实际应用中最大只能达到 120 O ，而 n 为介质折射率。由于香柏油的折射率（ 1.52 ）比空气及水的折射率（分别为 1.0 和 1.33 ）要高，因此以香柏油作为镜头于玻片之间介质的油镜所能达到的数值孔径值（NA 一般在1.2-1.4）要高于低倍镜、高倍镜等干镜（ NA 都低于 1.0）。若以可见光的平均波长 0.55 m来计算，数值孔径通常在0.65左右的高倍镜只能分辨出距离不小于0.4m的物体，而油镜的分辨率却可达到 0.2 m 左右。2革兰氏染色法是1884年

5、由丹麦病理学家Christain Gram氏创立的，革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌（G+）和革兰氏阴性菌（G-）两大类。革兰氏染色法是细菌学中最重要的鉴别染色法。革兰氏染色法所以能将细菌分为革兰氏阳性和革兰氏阴性，是由这两类细菌细胞壁的结构和组成不同决定的。实际上，当用结晶紫初染后，像简单染色法一样，所有细菌都被染成初染剂的蓝紫色。碘作为媒染剂，它能与结晶紫结合成结晶紫一碘的复合物，从而增强了染料与细菌的结合力。当用脱色剂处理时，两类细菌的脱色效果是不同的。革兰氏阳性细菌的细胞壁主要由肽聚糖形成的网状结构组成，壁厚、类脂质含量低，用乙醇(或丙酮)脱色时细胞壁脱水、使肽聚

6、糖层的网状结构孔径缩小，透性降低，从而使结晶紫-碘的复合物不易被洗脱而保留在细胞内，经脱色和复染后仍保留初染剂的蓝紫色。革兰氏阴性菌则不同，由于其细胞壁肽聚糖层较薄、类脂含量高，所以当脱色处理时，类脂质被乙醇(或丙酮)溶解，细胞壁透性增大，使结晶紫-碘的复合物比较容易被洗脱出来，用复染剂复染后，细胞被染上复染剂的红色。 （二） 实验器材1 菌种枯草芽孢杆菌1218h营养琼脂斜面培养物、金黄色葡萄球菌约24h营养琼脂斜面培养物、大肠杆菌24h营养琼脂斜面培养物2 溶液或试剂香柏油，二甲苯，结晶紫染色液、卢哥氏碘液、95%乙醇、番红染色液，蒸馏水3 仪器及相关用品 显微镜、擦镜纸、接种环、载玻片、

7、酒精灯、镊子（三） 实验方法1 显微观察 显微观察时应遵守从低倍镜到高倍镜再到油镜的观察程序。 油镜观察 高倍镜或低倍镜下找到要观察的样品区域后，用粗调节器将镜筒升高，然后将油镜转到工作位置。在待观察的样品区域加滴香柏油，从侧面注视，用粗调节器将镜筒小心地降下，使油镜浸在镜油中并几乎与标本相接。将聚光器升至最高位置并开足光圈，若所用聚光器的数值孔径值超过 1.0 ，还应在聚光镜与载玻片之间也加滴香柏油，保证其达到最大的效能。调节照明使视野亮度合适，用粗调节器将镜筒徐徐上升，直至视野中出现物像并用细调节器使其清晰准焦为止。 2革兰氏染色（1） 涂片  常规涂片法 取一洁净的载

8、玻片，用特种笔在载玻片的左右两侧标上菌号，并在两端各滴一小滴蒸馏水，以无菌接种环分别挑取少量菌体涂片，干燥、固定。玻片要洁净无油，否则菌液涂不开。 （2） 初染 滴加结晶紫(以刚好将菌膜覆盖为宜)于两个玻片的涂面上，染色12min ，倾去染色液，细水冲洗至洗出液为无色，将载玻片上水甩净。 （3）  媒染用卢戈氏碘液媒染约1 min ，水洗。 （4）  脱色 用滤纸吸去玻片上的残水，将玻片倾斜，在白色背景下，用滴管流加95%的乙醇脱色，直至流出的乙醇无紫色时，立即水洗，终止脱色，将载玻片上水甩净。 革兰氏染色结果是否

9、正确，乙醇脱色是革兰氏染色操作的关键环节。脱色不足，阴性菌被误染成阳性菌，脱色过度，阳性菌被误染成阴性菌。脱色时间一般约2030s。 （5）  复染 在涂片上滴加番红液复染约23min ，水洗，然后用吸水纸吸干。在染色的过程中，不可使染液干涸。 （6） 镜检 干燥后，用油镜观察。判断两种菌体染色反应性。菌体被染成蓝紫色的是革兰氏阳性菌（G+），被染成红色的为革兰氏阴性菌（G-）。4用毕后的处理    （1）上升镜筒，取下载玻片。     （2） 用擦镜纸拭去镜头上的镜油，然后用擦镜纸蘸少许二甲苯

10、（香柏油溶于二甲苯）擦去镜头上残留的油迹，最后再用干净的擦镜纸擦去残留的二甲苯。    （3）用擦镜纸清洁其他物镜及目镜；用绸布清洁显微镜的金属部件。    （4）分还原，反光镜垂直于镜座，将物镜转成“八”字形，再向下旋。同时把聚光镜降下，以免接物镜与聚光镜发生碰撞危险。染色玻片用洗衣粉水煮沸、清洗，凉干后备用。（四） 实验结果1 绘出你在油镜下观察到的三种菌的形态2 列表简述两株细菌的染色结果(菌的形状、颜色和革兰氏染色反应)。（五） 思考题1、用油镜观察时应注意哪些问题？在载玻片和镜头之间加滴什么油？起什么作用？ 2、影响显微镜分辨率的因素

11、有哪些？ 3、 进行革兰氏染色时，为什么特别强调菌龄不能太老，用老龄细菌染色会出现什么问题? 4、 你认为制备细菌染色标本时，应该注意哪些环节? 实验二 沉降法检测空气中微生物数量（一） 实验目的1学习并掌握用沉降法检测空气中的微生物2了解空气中微生物的分布状况（二）实验原理在我们周围的环境中存在着种类繁多、数量庞大的微生物。空气中也不例外。虽然空气不是微生物栖息的良好环境。但由于气流、灰尘和水沫的流动，人和动物的活动等原因，仍有相当数量的微生物存在。当空气中个体微小的微生物落到适合于它们生长繁殖的固体培养基的表面时，在适温下培养一段时间后，每一个分散的菌体或孢子就会形成一

12、个个肉眼可见的细胞群体即菌落。观察大小、形态各异的菌落，就可大致鉴别空气个存在的微生物的种类。（三)实验器材1 试剂牛肉蛋白胨培养基配方：牛肉膏 , 蛋白胨 ，NaCl 5g马铃薯培养基配方：马铃薯 200g, 蔗糖 20g高氏一号培养基配方：淀粉 20g, 硝酸钾 , 磷酸氢二钾 , 硫酸镁, 氯化钠, 硫酸亚铁2. 仪器及其他用品高压灭菌锅，操作工作台，三角瓶，培养皿，酒精灯，培养箱等（四）实验方法1倒平板：按常法配置上述培养基，分装于三角瓶中，高压灭菌备用。临用前将培养基熔化，冷却至50左右，各倒16个平板备用。2暴露取样在指定的地点草地，一层楼，三层楼，七层楼各放4皿，将平板皿盖打开，

13、在空气中暴露5min和10min,时间一到，立即合上皿盖。3 培养观察： 细菌置于37培养，放线菌培养基平板和真菌培养基平板置于28培养。细菌培养48h，真菌和放线菌培养4-6天。计数平板上的菌落，观察各种菌落的形态、大小、颜色等特征。1m3空气中微生物的数目奥梅染斯基（）曾建议：如面积为1002的平板培养基，暴露在空气中5分钟，置于37培养24小时后所生长的菌落数，相当于10L空气中的细菌数。N×100×1002X=X：每m3空气中的细菌数N：平板暴露5分钟，置37培养24小时后生长的菌落数r：平皿底半径（）（五）实验结果1列表比较不同放置地点空气菌落种类以及数量的差异？

14、 菌落平均数环境细菌霉菌放线菌室外5min10min室内5min10min2用沉降法计算1m3空气环境中所含菌数。（六）思考题1对沉降测定法的结果，进行分析。实验三 多管发酵法检测水中的大肠菌群（一） 实验目的1. 了解饮用水和水源水大肠菌群的原理和意义2学习检测水中大肠菌群的方法 （二）实验原理 大肠菌群是评价水质好坏的一个重要的卫生指标，也是反映水体被生活污水污染的一项重要监测项目。大肠菌群是一群以大肠埃希氏菌（Escherichiacoli）为主的需氧及兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌，在37生长时，能在48小时内发酵乳糖并产酸产气。我国生活饮用水卫生标准中规定一升水样中总大肠菌群数不超过

15、三个。多管发酵法包括初发酵试验、平板分离和复发酵试验三个部分。发酵管内装有乳糖蛋白胨液体培养基，并倒置一德汉氏小套管。乳糖能起选择作用，因为很多细菌不能发酵乳糖，而大肠菌群能发酵乳糖而产酸产气。1初发酵试验水样接种于发酵管内，37下培养，24小时内小套管中有气体形成，并且培养基混浊，颜色改变，说明水中存在大肠菌群，为阳性结果。48小时后仍不产气的为阴性结果。2平板分离初发酵管24至48小时内产酸产气的均需在复红亚硫酸钠琼脂（远藤氏培养基，Endos medium）或伊红美蓝琼脂（eosin methylene blue agar,EMB agar）平板上划线分离菌落。3复发酵试验以上大肠菌群阳

16、性菌落，经涂片染色为革兰氏阴性无芽孢杆菌者，通过此试验再进一步证实。原理与初发酵试验相同，经24小时培养产酸产气的，最后确定为大肠菌群阳性结果。（二） 实验器材1. 水样自来水2试剂乳糖蛋白胨发酵管（内有倒置小套管），三倍浓缩乳糖蛋白胨发酵管（瓶）（内有倒置小套管），伊红美蓝或复红亚硫酸钠琼脂平板，革兰氏染液。3 仪器及其它用品 载玻片，灭菌带玻璃塞空瓶，灭菌吸管，灭菌试管，革兰氏染液，显微镜，香柏油，二甲苯，擦镜纸，吸水纸，灭菌三角瓶等。（四） 实验方法1 水样的采取水源水2初发酵试验 取16支发酵管，其中10支用移液管加入10ml一倍的乳酸蛋白胨培养液，5支加入5ml三倍乳糖蛋白胨培养液，

17、1支加入9ml自然水。完成后包装好，于121高压灭菌锅中灭菌30min左右。冷却后，在无菌操作条件下，向装有三倍的乳酸蛋白胨培养液的5支试管加入10ml水样，向装有一倍的乳糖蛋白胨培养液的5支试管中加入1ml水样，向装有一倍的乳酸蛋白胨培养液的另5支试管中加入1ml 10-1水样。 将各试管充分混均，置于37恒温箱中培养24h。（2）平板分离 经24小时培养后，将产酸产气及48小时产酸产气的发酵管（瓶）液体，分别划线接种于伊红美蓝琼脂平板上，再置于37下培养1824小时，将符合下列特征的菌落的一小部分，进行涂片，革兰氏染色，镜检。（a）深紫黑色、有金属光泽。（b）紫黑色、不带或略带金属光泽。（

18、c）淡紫红色、中心颜色较深。（3）复发酵试验 经涂片、染色、镜检，如为革兰氏阴性无芽孢杆菌，则挑取该菌落的另一部分，重新接种于普通浓度的乳糖蛋白胨发酵管中，每管可接种来自同一初发酵管的同类型菌落13个，37培养24小时，结果若产酸又产气，即证实有大肠菌群存在。证实有大肠菌群存在后，再根据初发酵试验的阳性管（瓶）数查表，即得大肠菌群数。表1 大肠杆菌群的最可能数（MPN单位：个·（100ml）-1出现阳性份数每100ml水样中细菌的最可能数95%可信限度值出现阳性份数每100ml水样中细菌的最可能数95%可信限度值10ml 管1ml管管下限上限10ml 管1ml管管下限上限000<

19、;24212697800127430279800102743133119302041144034129310027500237701014115013411891104115024315110111615510331193120615511461612020051351263211502017117520491713021071175217023170211922152294282202209221530792519023012328531110312503008119532140373103011122553318044500310112255401303530031114434541170

20、43190320144345422205770032117546543280908503301754654435012010004001333155024068750401175465513501201000410175465525401801400出现阳性份数每100ml水样中细菌的最可能数95%可信限度值出现阳性份数每100ml水样中细菌的最可能数95%可信限度值10ml 管1ml管管下限上限10ml 管1ml管管下限上限4112176355392030032004122697855416006405800420227675552400水样总量：55.5ml(5管10ml水样，5管0.1m

21、l水样，5管0.1 1:10稀释水样时，不同阳性和阴性情况下100ml水样中细菌的最可能数和95%可信限度值)（五）实验结果1查表1得每升水源水样中大肠菌群数是多少？ 出现阳性份数10ml 管1ml管管（六） 思考题 1为什么要选择大肠菌群作为水源被肠道病原菌污染的指示菌？实验四 活性污泥中生物相与放线菌、霉菌、酵母菌的形态观察（一） 实验目的1学习观察活性污泥中生物相的方法。2初步分析生物处理系统工作状态是否正常。3. 学习并掌握放线菌、霉菌、酵母菌形态结构的方法。4加深理解放线菌、霉菌、酵母菌形态结构特征（二）实验原理1活性污泥中生物相比较复杂，以细菌、原生动物为主，还有真菌、后生动物等。

22、某些细菌能分泌胶粘物质形成菌胶团，进而组成污泥絮绒体（绒粒）。在正常的成熟污泥中，细菌大多集于菌胶团絮绒体中，游离细菌较少，此时，污泥絮绒体可具有一定形状、结构稠密、扩光率强、沉降性能好。原生动物常作为污水净化指标；当固着型纤毛虫优势时，一般认为污水处理池运转失常。当后生动物轮虫等大量出现时，意味着污泥极度衰老。2放线菌在固体培养基上呈辐射状生长而得名。放线菌是由不同长短的纤细的菌丝所形成的单细胞菌丝体。菌丝体分为两部分，即潜入培养基中的营养菌丝（或称基内菌丝）和生长在培养基表面的气生菌丝。有些气生菌丝分化成各种孢子丝，呈螺旋形、波浪形或分枝状等。孢子常呈圆形、椭圆形或杆形。气生菌丝及孢子的形

23、状和颜色常作为分类的重要依据。3. 霉菌菌丝较粗大，细胞易收缩变形，而且孢子很容易飞散，所以制标本时常用乳酸石炭酸棉蓝染色液。此染色液制成的霉菌标本片其特点是（a）细胞不变形；(b)具有杀菌防腐作用，且不易干燥，能保持较长时间；（c）溶液本身呈蓝色，有一定染色效果。霉菌的菌丝、分生孢子梗和分生孢子的形态常作为分类的重要依据。4. 酵母菌是多形的、不运动的单细胞微生物，细胞核与细胞质已有明显的分化，菌体比细菌大。繁殖方式也较复杂，无性繁殖主要是出芽生殖，仅裂殖酵母属是以分裂方式繁殖；有性繁殖是通过接合产生子囊孢子。本实验通过用美蓝染色浸片来观察生活的酵母形态和出芽生殖方式。美蓝是一种无毒性染料，

24、它的氧化型是蓝色的，而还原型是无色的，用它来对酵母的活细胞进行染色，由于细胞中新陈代谢的作用。使细胞内具有较强的还原能力，能使美蓝从蓝色的氧化型变为无色的还原型，所以酵母的活细胞无色，而对于死细胞或代谢缓慢的老细胞，则因它们无此还原能力或还原能力极弱，而被美蓝染成蓝色或淡蓝色。因此，用美蓝水浸片不仅可观察酵母的形态，还可以区分死、活细胞。（三）实验器材1活性污泥样品2菌种放线菌、 霉菌、酵母菌3. 试剂0.1%吕氏碱性美蓝染液4仪器以及其它用品显微镜，目镜测微尺，200ml量筒、载玻片、盖玻片、玻璃小吸管、橡皮吸头、镊子。吸水纸， 香柏油，二甲苯（四）实验方法1活性污泥生物相的观察（1）肉眼观

25、察：取曝气池的混合液置于100ml量筒内，直观活性污泥在量筒中呈现的絮绒体外观及沉降性能（30分钟沉降后的污泥体积）。（2）制片镜检：滴混合液12滴于载玻片上，加盖玻片制成水浸标本片，在显微镜中倍或高倍镜下观察生物相。丝状微生物：伸出絮绒体外的多寡，以哪一类为优势？见本实验附注1。微型动物：原生动物的识别。常见后生动物特征描述见本实验附注2。2. 放线菌的观察直接观察法用镊子连同培养基挑取放线菌菌苔置载玻片中央。放在洁净的载玻片上，选择菌苔边缘部位，在显微镜下依次用低倍镜、中倍镜、高倍镜直接观察，观察时需不断调节微调，仔细观察气生菌丝，基内菌丝和孢子丝的形状。 插片观察法 将高氏1号培养基倒入

26、无菌培养皿，制成4左右的培养基平板，经培养检验后无菌，备用。然后将孢子悬液涂皿（浓度以稀释10-210-3为好）。用火焰灭菌的镊子将无菌盖玻片以45度倾斜角插入平皿培养基琼脂内， 倒置，于28培养45天后，小心地将盖玻片取出，把有菌的一面朝上，放在载玻片上，置显微镜下进行观察。一般情况是气生菌丝颜色较深，并比营养菌丝粗二倍左右。3霉菌的观察用镊子连同培养基挑取放线菌菌苔置载玻片中央。放在洁净的载玻片上，选择菌苔边缘部位，在显微镜下依次用低倍镜、中倍镜、高倍镜直接观察，观察时需不断调节微调，仔细观察菌丝，分生孢子梗和分生孢子。4. 酵母菌的观察（1）在载玻片中央加一滴0.1%吕氏碱性美蓝染液，液

27、滴不可过多或过少，以免盖上盖玻片时，溢出或留有气泡。然后按无菌操作法取在琼脂斜面上培养48小时的酵母菌少许，放在吕氏碱性美蓝染液中，使菌体与染液均匀混合。（2）用镊子夹盖玻片一块，小心地盖在液滴上。盖盖玻片时应注意，不能将盖玻片平放下去，应先将盖玻片的一边与液滴接触，然后将整个盖玻片慢慢放下，这样可以避免产生气泡。（3）将制好的水浸片放置3分钟后镜检。先用低倍镜观察，然后换用高倍镜观察酵母菌的形态和出芽情况，同时可以根据是否染上颜色来区别死、活细胞。（4）染色半小时后，再观察一下死细胞数是否增加。（5）用0.05%吕氏碱性美蓝染液重复上述的操作。（五）实验结果1将镜检结果填于下表中，并列出所见

28、主要生物。活性污泥来源，采样日期丝状微生物原生动物后生动物3绘图说明你所观察到的放线菌、酶菌以及酵母菌的形态特征。（六）思考题 1根据实验观察情况，试对活性污泥质量及运行情况作初步评价。2.在自然界和实际应用中放线菌有什么作用？（七）附录1活性污泥中常见的丝状微生物（1）球衣菌（Sphaerotilus）：由许多圆柱形细胞排列成链，外面包围一层衣鞘，形成丝状体。具有假分枝。单个菌体可自衣鞘游出，活泼运动或粘附于鞘外。（2）贝氏硫菌（Beggiatoa）：无色而宽度均匀的丝状体，与球衣菌不同的是外面无衣鞘，各丝状体分散不相连接。丝状体由圆柱形细胞紧密排列而成，有时可见硫粒。丝状体不固着于基质上，

29、可呈匍匐状滑行，菌体扭曲、穿插匍匐滑行于污泥之中。（3）发硫菌（Thiothrix）：亦由细胞排列成丝状体，具薄鞘但一般镜检时不可见。其丝状体基部有吸盘，可使菌体固着于基质上生长。在附着生长时，有时菌丝体左右平等伸长成羽毛状，有时以放射状从活性污泥絮绒体内向四周伸展，有时菌丝体交织在一起自成中心向四周伸展。（4）霉菌（mould）：活性污泥中常见到菌丝体远较上述细菌为粗大的霉菌菌丝体和霉菌孢子。菌丝体有的有隔，并具有真分枝。2活性污泥中常见的后生动物（1）线虫（Nematoda）：身体细长呈线形，其横切面呈圆形。常见卷曲不能自由伸缩，而是靠身体作蛇形扭曲而运动。（2）轮虫（Rotifera）：

30、形体很小，身体的前端或靠近前端有轮盘（头冠），其上的纤毛经常摆动，有游泳和摄食的功能。在口腔或口管下面的咽喉部分膨大而形成咀嚼囊，内有一套较复杂的咀嚼器，可以多少地伸出口外以攫取食物。（3）颤体虫（Aeolosoma）：在活性污泥中最大、分化最高级的一种多细胞动物，身体分节，节间有刚毛伸出，体表具有带色泽的油点。实验五 土壤中微生物的分离与纯化（综合性实验）（一） 实验目的1 明确培养基的配制原理，并通过对微生物培养基的配制，掌握配制培养基的一般方法和步骤，学习分离纯化微生物的基本操作技术。进一步熟练和掌握微生物无菌操作技术；掌握微生物培养方法以及接种技术。（二）实验原理培养基是人工地将多种物

31、质按各种微生物生长的需要配制而成的一种混合营养基质，用以培养或分离各种微生物。因此，营养基质应当有微生物所能利用的营养成分（包括碳源、氮源、能源、无机盐、生长因素）和水。根据微生物的种类和实验目的不同，培养基也有不同的种类和配制。在土壤、水、空气或及动、植物体中，不同种类的微生物绝大多数都是混杂生活在一起，当我们希望获得某一种微生物时，就必须从混杂的微生物类群中分离它，以得到只含有这一种微生物的纯培养，这种获得纯培养的方法称为微生物的分离与纯化。为了获得某种微生物的纯培养，一般是根据该微生物对营养、酸碱度、氧等条件要求不同，而供给它适宜的培养条件，或加入某种抑制剂造成只利于此菌生长，而抑制其他

32、菌生长的环境，从而淘汰其他一些不需要的微生物，再用稀释涂布平板法或稀释混合平板法或平板划线分离法等分离、纯化微生物，直至得到纯菌株。（三） 实验器材1 培养基与试剂牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏 5g，蛋白胨  10g ， NaCl  5g，琼脂 1520g ，H2O 高氏一号培养基：可溶性淀粉20g，K2HPO4 ， NaCl   ，MgSO4.7H2O   ，KNO3  1g ， FeSO4  ，琼脂 1520g ，H2O 1000ml，马铃薯蔗糖培养基：

33、去皮马铃薯200g, 蔗糖20g，琼脂1520g，H2O 1000ml, pH自然。1%链霉素，0.5%重铬酸钾，结晶紫染液，卢戈氏碘液，95%乙醇，番红2 仪器以及其他用品高压灭菌锅，超净工作台，普通光学显微镜，培养皿， 移液器， 天平，灭菌的袋子，小铲，250ml三角锥形瓶，250ml烧杯，药勺，无菌培养皿，盛9m1无菌水的试管6支、盛45m1无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶、无菌玻璃珠、接种环、酒精灯、显微镜、称量纸等。（四） 实验方法1土壤取样根据实验的目的选取采样地点，把采到的土壤装进取样袋后直接带回微生物实验室立即使用或放入4的冰箱备用，但放置时间不要超过一天。2 培养基的制

34、备 培养基的类别 培养基配制原料 配置方法用于培养的菌种马铃薯蔗糖培养基 马铃薯200g，葡萄糖20g, 琼脂20g，水1000ml。将马铃薯去皮切块，加1000mL蒸馏水，煮沸1020min。用纱布过滤，补加蒸馏水至1000mL。加入琼脂，加热溶化，分装，121高压灭菌20min。霉菌酵母菌 高氏1号培养基  可溶性淀粉20g,KNO3 1g,NaCl ,K2HPO4·3H2O ,MgSO4·7H2O ,FeSO4·7H2O ,琼脂20g,水 1000mL，pH 试纸。 先将淀粉溶入

35、烧杯中加热搅拌至完全溶解，再加入其他成分依次溶解，最后加水至1000mL。调pH7.27.4，加入琼脂，加热溶化，分装，121高压灭菌20min。 放线菌 牛肉膏蛋白胨培养基 牛肉膏5g，蛋白胨10g，NaCl 5g,琼脂20g，水1000ml，pH 试纸 。先将牛肉膏、蛋白胨溶入烧杯中加热搅拌至完全溶解，再加入其他成分依次溶解，最后加水至1000mL。调pH7.27.4，加入琼脂，加热溶化，分装，121高压灭菌20min。 细菌将配置好的培养基，用报纸包扎好的培养皿、用橡胶塞封好的盛有9mL的试管、枪头和装有45mL蒸馏水与玻璃珠的三角锥瓶，玻璃珠放到高压灭菌锅进行高温蒸汽灭菌。4微生物的分离（1）倒平